宏基因组二代测序对下呼吸道感染分枝杆菌的诊断和鉴别诊断价值

The Diagnostic and Differential Diagnostic Value of Metagenomic Next-Generation Sequencing for Mycobacterial Infections in the Lower Respiratory Tract

摘要: 目的：探讨利用宏基因组二代测序技术(mNGS)，对下呼吸道感染病人的肺泡灌洗液(BALF)进行检测，对分枝杆菌诊断及鉴别诊断的应用价值。方法：回顾性分析2019年7月至2024年8月在青岛大学附属医院呼吸与危重症医学科因下呼吸道感染住院的509例病人临床资料和BALF样本分枝杆菌检出情况。结果：在509例BALF样本中，抗酸染色阳性31例，阳性率为6.09%；mNGS检测出分枝杆菌92例，阳性率为18.07%。两者检测结果具有显著差异(χ² = 12.98, P < 0.05)。在92例分枝杆菌中，结核分枝杆菌复合群(MTBC) 55例，占59.78%；非结核分枝杆菌(NTM) 37例，占40.22%，其中鸟–胞分枝杆菌复合群(MAC) 31例、堪萨斯分枝杆菌1例、慢生黄分枝杆菌2例和脓肿分枝杆菌3例。非结核分枝杆菌中，MAC占83.78% (31/37)。mNGS检测显示，男、女患者BALF样本中MTBC的检出差异具有统计学意义(χ² = 4.6761, P < 0.05)，而不同年龄组中分枝杆菌的检出差异无统计学意义。在MTBC和MAC阳性患者中，合并感染类型存在差异，差异具有统计学意义。结论：mNGS可以提供对分枝杆菌的快速诊断和鉴别诊断，有助于临床及时、精准、有效的治疗。

Abstract: Objective: To explore the application value of diagnosis and differential diagnosis for the detection of mycobacteria in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of patients with lower respiratory tract infections using metagenomic next-generation sequencing (mNGS). Methods: A retrospective analysis was conducted on the clinical data and BALF mycobacteria detection results of 509 patients with lower respiratory tract infections who were admitted to the Department of Respiratory and Critical Care Medicine at The Affiliated Hospital of Qingdao University from July 2019 to August 2024. Results: Among the 509 BALF samples, 31 were positive for acid-fast staining, resulting in a positivity rate of 6.09%. The mNGS identified 92 cases of mycobacteria, with a positivity rate of 18.07%. There was a significant difference between the two detection methods (χ² = 12.98, P < 0.05). Among the 92 identified mycobacteria, 55 cases were of the Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC), accounting for 59.78%, while 37 cases were non-tuberculous mycobacteria (NTM), accounting for 40.22%. Within the NTM group, 31 cases were Mycobacterium avium complex (MAC), 1 case was Mycobacterium kansasii, 2 cases were slow-growing yellow mycobacteria, and 3 cases were Mycobacterium abscessus; MAC comprised 83.78% (31/37) of the NTM cases. The mNGS results indicated a statistically significant difference in the detection of MTBC between male and female patients (χ² = 4.6761, P < 0.05), while there was no statistically significant difference in the detection of mycobacteria among different age groups. Furthermore, the types of co-infections found in MTBC and MAC-positive patients exhibited significant differences. Conclusion: mNGS can provide a rapid and accurate method for the diagnosis and differential diagnosis of mycobacteria, facilitating timely and effective clinical treatment.

1. 引言

下呼吸道感染因其高发病率、高病死率和高负担[1] [2]，仍是临床医生亟需解决的难题之一。虽然大多数地区的年龄标准化发病率、病死率和残疾调整生命年率都有所下降[3]，但肺部感染仍是第四大死亡原因[4]。不同年龄组病人的主要致病菌各不相同，通常还伴有病毒和(或)真菌感染[5]。临床上尽早明确病原体，为病人争取更及时、更准确的治疗至关重要。目前，临床上一般以痰或支气管肺泡灌洗液(BALF)培养为诊断下呼吸道感染病原体的“金标准”，其他常规诊断方法包括痰涂片镜检、血清学和PCR等[6]，其缺点是培养周期长、覆盖病原体种类有限，尤其是分枝杆菌培养，不能满足临床快速、精准诊断的需要。分枝杆菌感染临床比较常见，但是确诊却有一定的困难，宏基因组二代测序技术(mNGS)在明确下呼吸道感染性疾病病原体方面具有较高的快速性和灵敏度，可帮助临床医生及早准确识别病原体，并进行及时而准确的治疗[7]-[9]。本研究回顾性分析509例因下呼吸道感染住院病人的临床资料，并对病人的BALF进行mNGS检测，探讨mNGS在下呼吸道感染病原体(尤其是分枝杆菌)诊断和鉴别诊断中的应用价值。

2. 资料与方法

2.1. 研究对象

以2019年7月~2024年8月在青岛大学附属医院呼吸与危重症医学科住院治疗的509例下呼吸道感染病人为研究对象，其中男性307例(60.31%)，女性202例(39.68%)，最大年龄92岁，最小年龄14岁，平均年龄(56.15 ± 12.56)岁。本研究经患者或者家属签署知情同意书，并通过医院伦理委员会批准(伦理批件号：QYFY WZLL 28437)。

2.2. 方法

2.2.1. BALF的采集

对需要明确病原体的下呼吸道感染病人进行电子支气管镜检查，在局部麻醉或舒适镇静的情况下，进行电子支气管镜检查，将电子支气管镜送入病变所在的支气管肺段或肺亚段，采用防污染灌洗管在室温下用无菌生理盐水多次灌洗，灌洗液总量为80~100 mL，充分吸出，留取BALF约60 mL，经过充分混合后，分别放入两个无菌采样管中，每管30 mL左右的BALF液，一份送检医院检验科，另一份送检mNGS检测机构。

2.2.2. 检测方法

1) mNGS检测方法：将按照标准采集的BALF进行mNGS检测，经DNA核酸提取、文库构建和上机测序后，对所得到的原始数据进行质控，与人类基因组序列比对；保留未匹配到的序列，与数据库中的微生物特异性序列进行进一步比对，最终报告结合病人的临床表现，确定下呼吸道感染的病原体(由南京迪飞医学科技完成mNGS检测)。

2) 医院检验科检测方法：将采集的BALF送检样本送到我院检验中心，对样本进行处理后，进行常规抗酸染色和细菌培养。

2.2.3. 统计学分析

采用SPSS 26.0软件进行数据统计分析。计数资料以例数和百分数表示，组间比较采用χ²检验，以P < 0.05为差异具有统计学意义。

3. 结果

3.1. 分枝杆菌总检出情况

在509例BALF样本检测中，检验科抗酸染色阳性31例，检测阳性率为6.09%；mNGS检测出分枝杆菌92例，检测阳性率为18.07%，两种检测方法一致率33.70% (31/92)，两种检测结果具有差异性(χ² = 12.98, P < 0.05)。见表1。92例分枝杆菌中，结核分枝杆菌复合群(MTBC) 55例，占比59.78% (55/92)；而非结核分枝杆菌(NTM) 37例，占比40.22% (37/92)，其中鸟–胞分枝杆菌复合群(MAC) 31例、堪萨斯分枝杆菌1例、慢生黄分枝杆菌2例和脓肿分枝杆菌3例。非结核分枝杆菌中，以鸟–胞分枝杆菌为主，占比83.78% (31/37)。见表2。

Table 1. Comparison of mNGS and acid-fast staining results from the clinical laboratory

表1. mNGS与检验科抗酸染色检测结果比较

mNGS	抗酸染色诊断		合计
	阳性	阴性
阳性	31	61	92
阴性	0	417	417
合计	31	478	509

注：mNGS为宏基因组二代测序。

Table 2. Specific distribution of mycobacteria detected by mNGS (cases)

表2. mNGS检测出的分枝杆菌具体分布情况(例)

项目	分枝杆菌(n = 92)		非结核分枝杆菌(n = 37)
	结核 分枝杆菌	非结核 分枝杆菌	鸟分支杆菌	堪萨斯 分枝杆菌	慢生黄 分枝杆菌	脓肿 分枝杆菌
例数	55	37	31	1	2	3
检出率(%)	59.78	40.22	83.78	2.70	5.41	8.11

3.2. 分枝杆菌在不同性别中的检出情况

在全部509例BALF样本中，男性BALF检测样本282例，女性BALF检测样本227例。结核分枝杆菌复合群(MTBC)在男、女两组的BALF样本的检出率分别为13.48% (38/282)和7.49% (17/227)，差异有统计学意义(χ² = 4.6761, P < 0.05)；鸟–胞分枝杆菌复合群(MAC)、堪萨斯分枝杆菌、慢生黄分枝杆菌和脓肿分枝杆菌在男、女两组的BALF样本检出中的差异无统计学意义。见表3。

Table 3. Detection of mycobacteria between different genders

表3. 不同性别间分枝杆菌的检出情况

分枝杆菌	男(n = 282)		女(n = 227)		χ^2值	P值
	例数	检出率(%)	例数	检出率(%)
MTBC	38	13.48	17	7.49	4.6761	<0.05
MAC	14	4.96	17	7.49	1.4011	0.2365
堪萨斯分枝杆菌	1	0.35	0	0	0.8065	0.3691
慢生黄分枝杆菌	2	0.71	0	0	1.6161	0.2036
脓肿分枝杆菌	2	0.71	1	0.44	0.1550	0.6938

注：MTBC为结核分枝杆菌复合群，MAC为鸟–胞分枝杆菌复合群。

3.3. 不同年龄组分枝杆菌检出情况

根据患者的检测年龄，将509例BALF检测样本分为四个年龄组，分析各年龄组中检测出分枝杆菌的情况。各年龄组的分枝杆菌的检出率分别为≤35岁年龄组26.53% (13/49)、36~50年龄组21.05% (16/76)、51~65年龄组15.82% (28/177)、>65岁年龄组16.91% (35/207)。不同年龄组分枝杆菌的检出率差异无统计学意义。见表4、表5。

Table 4. Detection of mycobacteria in different age groups

表4. 不同年龄组分枝杆菌的检出情况

年龄(岁)	n	检出例数	检出率(%)
≤35	49	13	26.53
36~50	76	16	21.05
51~65	177	28	15.82
>65	207	35	16.91

Table 5. Statistical analysis of mycobacteria detection in different age groups

表5. 不同年龄组分枝杆菌检出统计学分析情况

年龄(岁) 年龄(岁)	≤35		36~50		51~65
	χ^2值	P值	χ^2值	P值	χ^2值	P值
≤35	/	/	/	/	/	/
36~50	0.5018	0.4787	/	/	/	/
51~65	2.9651	0.0851	1.0141	0.3140	/	/
>65	2.4081	0.1207	0.6463	0.4214	0.0825	0.4214

3.4. 分枝杆菌合并其他致病菌检出情况

在509例患者的BALF检测中，MTBC合并细菌感染者33例，而MAC 17例，两者比较具有差异性(χ² = 5.3841, P < 0.05)；MTBC合并真菌感染7例，MAC患者17例，两者比较有统计学差异(χ² = 4.2671, P < 0.05)；MTBC同时合并细菌和真菌感染者9例，MAC患者7例，两者比较无差异性(χ² = 0.6091, P > 0.05)；单纯MTBC感染者10例，MAC感染者3例，两者比较无差异性(χ² = 3.8181, P > 0.05)。见表6。

Table 6. Comparison of co-detection of viruses and fungi between MTBC and MAC (cases)

表6. MTBC和MAC合并病毒和真菌检出情况比较(例)

项目	BALF检测样本中细菌表达情况(n = 509)
	细菌^a	真菌^b	细菌和真菌	均未检出
合并MTBC	33	7	9	10
合并MAC	17	17	6	3
χ^2值	5.3841	4.2671	0.609	3.8181
P值	<0.05	<0.05	0.4352	0.0507

^a检出细菌前5位包括：肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌。^b检出真菌前3位包括：白色念珠菌、烟曲霉、耶氏肺孢子菌。

4. 讨论

宏基因组高通量测序技术(mNGS)通过对临床样本中微生物和宿主核酸的测序分析，能够无偏倚地检测多种病原微生物，逐渐应用于临床感染性疾病病原检测[10]。mNGS具有广泛的覆盖范围和快速检测等优点，能检测到更广泛的病原体[11]。随着其在临床应用的不断进步，mNGS在各种感染性疾病中的应用得到了广泛的关注和认可[12]，其高灵敏度可帮助临床医生尽早、准确地诊断病原体，尤其是对分枝杆菌感染的检测，为精准治疗提供了科学依据[13]。本研究中，509例下呼吸道感染患者的BALF样本中，mNGS共检测到92例分枝杆菌，阳性率为18.07%，而医院检验科的抗酸染色阳性率仅为6.09%。对92例检出分枝杆菌的下呼吸道感染患者的临床症状和影像学表现进行回顾性分析，符合分枝杆菌确诊感染表现。这表明，mNGS的检测阳性率远高于医院检验科的常规抗酸染色检测方法，为临床医生制定治疗方案提供了有力保障。

常规抗酸染色是一种重要的实验室检测方法，广泛用于识别分枝杆感染。虽然在识别分枝杆菌感染中具有重要作用，但也存在一些缺点和局限性，例如，抗酸染色只能指示样本中是否存在抗酸性分枝杆菌，但无法区分结核分枝杆和非结核分枝杆菌，这导致在阳性结果出现时，无法立即确定感染类型，从而影响后续的诊断和治疗决策。在本研究中，mNGS共检测到92例分枝杆菌，5种类型分枝杆菌。其中结核分枝杆菌复合群55例，占比59.78% (55/92)；而非结核分枝杆菌37例，占比40.22% (37/92)；在非结核分枝杆菌感染中，以鸟–胞分枝杆菌为主，占比83.78% (31/37)，其余为堪萨斯分枝杆菌1例、慢生黄分枝杆菌2例和脓肿分枝杆菌3例。研究发现，对于分枝杆菌的鉴别诊断，mNGS可以表现出其快速、准确、灵敏等优越性。通过对分枝杆菌特定基因的测序，mNGS能准确识别不同种类的分枝杆菌，包括结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。这有助于确定感染的具体类型，以便进行针对性的治疗。采用传统方法对分枝杆菌培养后再进行菌型鉴定，大约需要1个月的时间获得结果，而mNGS的检测速度显著提高，可以在几天内获得结果，帮助临床医生及时作出治疗决策。mNGS在分枝杆菌的诊断和鉴别诊断方面提供了高灵敏度、无偏倚的全面检测能力，能够快速提供详细的微生物信息。

既往研究报道，分枝杆菌感染，尤其是结核分枝杆菌感染，通常会伴随其他细菌和真菌感染[9]，而鸟–胞分枝杆菌感染者则容易合并真菌感染，真菌中主要检出曲霉菌、念珠菌和日本肺孢子菌，这些真菌是肺部侵袭性真菌感染的主要病原体[14]-[17]。在本研究中，我们分析MTBC、MAC合并细菌、真菌等病原体的检出情况和差异性，结果显示，MTBC和MAC阳性病人在合并细菌、真菌感染方面存在统计学差异，MAC更有可能合并真菌感染，而MTBC更有可能合并细菌感染。

mNGS用于检测分枝杆菌时，性别因素的影响是一个复杂的问题。在本研究中，我们分析了是否存在性别对分枝杆菌感染检测有影响。研究结果显示，结核分枝杆菌的检测率在男性中的检出比例高于女性，差异具有统计学意义，与文献报道相一致[18]。研究结果提示，性别可能是结核分枝杆菌的一个显著影响因素，这种差异可能与性别相关的行为(如吸烟、酗酒)以及社会经济因素有关[19]。同时，我们又分析了不同年龄组之间分枝杆菌的检出情况，探究年龄是否也是影响分枝杆菌检测结果的一个重要影响因素[20]，研究结果显示，不同年龄组分枝杆菌的检出差异无统计学意义。

mNGS在判断罕见或难以培养的病原菌感染方面具有突出优势，有助于指导个体化治疗，减少早期未明确病原体时经验性用药所致的耐药性。对于分枝杆菌、病毒和支原体等，传统的分离培养条件苛刻且耗时长[21]，阳性率低；而且mNGS可以提取和比对病变样本中所有微生物的遗传信息，不仅可以尽早区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，还可以提高时效性和灵敏度[22]-[25]。然而，mNGS也有其局限性，检测结果复杂，目前仍缺乏公认的解释标准，仍需结合传统检测结果分析。

综上所述，mNGS可以提高肺部感染病人BALF样本的病原学阳性率，与常规方法相结合，可为临床病例分枝杆菌、病毒和真菌的精准诊断提供指导。

基金项目

青岛市科技计划项目资助课题(18-6-1-77-nsh)。

NOTES

^*通讯作者。