摘要: 目的：细胞焦亡是阿尔兹海默症相关的重要炎症过程。本研究在已有研究的基础上，进一步筛选鉴定阿尔兹海默症中细胞焦亡的潜在生物学靶点。材料方法：首先，从基因表达综合数据库中筛选mRNA表达谱数据集GSE5281，并使用R软件(4.0.0版)分析阿尔兹海默症和细胞焦亡相关的潜在差异表达基因。随后，对选定的候选基因进行蛋白质–蛋白质相互作用分析、基因本体富集分析和京都基因与基因组百科全书通路富集分析等。并最终根据hub基因的排名，筛选出可能的潜在靶向基因。结果：差异性分析确定了768个可能的与阿尔兹海默症相关的潜在靶点。通过开放的细胞焦亡数据库，我们进一步筛选出76个细胞焦亡相关的差异基因。蛋白质–蛋白质相互作用网络展示出绝大多数候选靶点存在密切的相互作用。并筛选出了网络中核心的hub基因。结论：我们的研究鉴定了76个阿尔兹海默症中潜在的细胞焦亡相关的差异表达基因。并借助蛋白质互作网络总结出可能最值得关注的前10个hub基因(SOD1、YWHAB、TUBB4B、TUBB、TUBA1C、GJA1、GAPDH、HSP90AB1、HSPA8和YWHAZ)。本研究结果可能有助于进一步了解阿尔兹海默症的发病机制，并指导治疗。
Abstract: Objective: Pyroptosis is an important inflammatory process associated with Alzheimer’s disease (AD). On the basis of previous studies, this study aims to further screen and identify the potential biological targets of pyroptosis in AD. Material Method: Firstly, the mRNA expression profile dataset GSE5281 was screened from the Gene Expression Omnibus database, and the potential differentially expressed genes related to Alzheimer’s disease and pyroptosis were analyzed by R software (version 4.0.0). Subsequently, the selected candidate genes were subjected to protein-protein interaction analysis, Gene Ontology enrichment analysis, and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway enrichment analysis. Finally, according to the ranking of hub genes, the possible potential target genes were screened out. Result: Differential analysis identified 768 potential AD targets. Through the open pyroptosis database, we further screened 76 differentially expressed genes related to pyroptosis. The protein-protein interaction network showed that the vast majority of candidate targets had close interactions. The core hub genes in the network were screened out. Conclusion: Our study identified 76 differentially expressed genes potentially involved in pyroptosis in AD. The top 10 hub genes (SOD1, YWHAB, TUBB4B, TUBB, TUBA1C, GJA1, GAPDH, HSP90AB1, HSPA8 and YWHAZ) were summarized by protein-protein interaction network. The results of this study may contribute to further understanding of the pathogenesis of AD and guide treatment.
1. 介绍
阿尔茨海默病是痴呆最常见的原因，是一个日益增长的全球健康问题，对个人和社会都有重大影响[1]。这是一个无法治愈的过程，通常会导致死亡。这种疾病是多因素的，其中一个因素是炎症[2]。炎症细胞分泌的多种介质可能导致神经元退化。神经炎可能与阿尔茨海默病的其他机制共存，促进疾病进展，也可能直接导致阿尔茨海默病。尽管关于阿尔茨海默病发病机制中的炎症过程已有大量研究，但许多方面仍未得到解释[2]。
细胞焦亡是一种程序性细胞死亡的裂解形式，由称为gasdermins的成孔蛋白执行[3]。典型的细胞焦亡由炎症小体组装介导，伴随GSDMD切割以及IL-1β和IL-18的释放[4] [5]。炎症小体是多分子复合物，当宿主对微生物感染具有抗性时会被激活，同时促进适应性免疫反应的发展。细胞焦亡在阿尔兹海默症相关的检验与治疗中具有重要意义[6]。阿尔茨海默症患者神经元和小胶质细胞中炎症小体表达升高，表明经典的焦亡通路可能驱动阿尔茨海默病相关神经病理变化[7] [8]。例如，未折叠微管蛋白tau聚集体可激活NLRP3，促进炎症性细胞因子表达，加重阿尔茨海默症的神经炎症[9]。而Aβ寡聚体/纤维结合并激活NLRP3炎症小体，诱导细胞转变为炎症性M1表型，导致促炎细胞因子分泌增加，最终导致小鼠海马体中Aβ沉积和认知功能障碍[10] [11]。由此可见，进一步甄选与交往相关的潜在生物学靶点对于协助我们进一步了解阿尔兹海默症至关重要的。
2. 材料方法
2.1. 相关基因数据集和微阵列数据
从GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease, AD)转录组数据集GSE5281以及样本的临床信息，其中包含了87个AD样本和74个对照样本，采用的是GPL570 [HG-U133_Plus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array注释平台文件。
在Genecards数据库(https://www.genecards.org/)中以“pyroptosis”为关键词检索到的细胞焦亡相关基因，其中包含了1767个细胞焦亡相关基因(pyroptosis)。
2.2. 差异表达细胞焦亡相关基因的分析
差异基因分析旨在找出不同样本组间差异的基因，并对差异基因做后续更深入的功能挖掘。利用limma包对数据集中疾病样本和对照样本进行差异表达基因分析，得到相应的P.Value值和logFC值，采用Benjamini & Hochberg方法进行多重检验校正，得到校正后P值即adj.P.Value，差异阈值设定为：adj.P.Value < 0.05&|log2fold change (FC)| > 1。
2.3. 基因本体论和京都百科全书的基因和基因组通路富集细胞焦亡相关基因的分析
基因本体论(Gene ontology, GO)系统包括三个部分：生物学过程(biological process, BP)、分子功能(molecular functions, MF)、细胞组分(cellular components, CC)。基于上述得到的76个差异细胞焦亡基因，使用R包ClusterProfiler分析上述其参与的生物学过程(biological process, BP)、分子功能(molecular functions, MF)、细胞组分(cellular components, CC)和KEGG pathway富集分析。显著性阈值P.Value < 0.05得到显著富集结果，结果共富集得到698个GO BP、146个GO MF、115个GO CC和28条KEGG pathway。我们按照P.Value由小到大排名分别选取GO和KEGG各TOP 10富集结果进行展示如图2所示。
2.4. 差异表达细胞焦亡相关基因的蛋白质–蛋白质相互作用及相关性分析
我们利用STRING数据库(https://string-db.org/)对进行PPI网络构建。置信度为0.4 (medium Confidence = 0.4)，去除离散的蛋白，得到211个蛋白互作关系对，然后用Cytoscape软件对蛋白网络图进行美化。接着利用cytohubba插件下的degree算法进行拓扑性质分析，根据连接度排序，选择TOP 10基因进行可视化。
2.5. 统计分析
使用R软件(4.0.0版)对生物信息学数据进行统计分析。学生t检验用于评估临床样本中的基因表达水平。P值 < 0.05表示差异具有统计学意义。
3. 结果
3.1. 阿尔兹海默症中基因差异表达的回顾性分析
差异性分析共能获得768个差异基因。为了从整体上了解差异基因的分布，我们用火山图来展示其分布情况(图1(a))；热图是对实验数据分布情况进行分析的直观可视化方法，可以用来进行实验数据的质量控制和直观展示重点研究对象的表达量数据差异变化情况。我们绘制的热图展示了疾病样本和对照样本中按照差异倍数排名选取上下调各TOP 50差异基因的表达情况(图1(b))。
(a) (b)
图1(a)为GSE5281差异性分析的火山图，横坐标为log2FC值，纵坐标为−log10 (P.Value值。图中每个点代表一个基因，右侧的点表示其基因表达量是显著上调的(AD相对于Control)，左侧的点表示其基因表达量是显著下调的(AD相对于Control)，基因从红色到蓝色代表显著性下降；图1(b)为GSE5281差异性分析的热图，红色的图块表示其基因表达量是显著上调的(AD相对于Control)，蓝色的图块表示其基因表达量是显著下调的(AD相对于Control)，颜色越深表示差异越大。
Figure 1. Differential analysis of GSE5281
图1. GSE5281差异性分析
3.2. 阿尔兹海默症中差异表达基因与细胞焦亡数据库交集
用R包VennDiagram对上述得到的疾病样本和正常样本间的差异基因(DEGs)、细胞焦亡相关基因(pyroptosis)进行取交集，绘制了韦恩图(图2)，获得了76个差异细胞焦亡相关基因。
3.3. 候选的76个细胞焦亡相关基因的基因本体富集分析
基因本体富集分析(GO)的结果显示候选基因们的功能在生物过程方面主要集中于细胞器定位(图3(a)。而在细胞组分方面主要集中于细胞基地链接和焦亡黏附(图3(b))。在分子功能方面，候选基因们则主要与脒基核苷酸链接有关(图3(c))。另一方面，我们同时也进行了京都基因与基因组百科全书(KEGG)基因富集分析，发现候选基因主要参与了与多种疾病相关的神经退化通路的激活(图3(d))。
3.4. 蛋白质–蛋白质相互作用网络分析
蛋白质–蛋白质相互作用网络(Protein-protein interaction, PPI)分析显示大部分候选基因中存在着密切的相互作用(图4)。而互作桥对位列前十的hub基因则是：SOD1、YWHAB、TUBB4B、TUBB、TUBA1C、GJA1、GAPDH、HSP90AB1、HSPA8和YWHAZ (图5)。除去GAPDH，PPI桥对数最高的候选基因为HSP90AB1 (26对)，其次为HSPA8 (24对)。因此重点关注这些基因可能可以更好的了解阿尔兹海默症的发生机制。
图2用R包VennDiagram对上述得到的疾病样本和正常样本间的差异基因(DEGs)、细胞焦亡相关基因(pyroptosis)进行取交集，获得了76个差异细胞焦亡相关基因。
Figure 2. Intersection venn diagram of differentially expressed genes and pyroptosis database in Alzheimer’s disease
图2. 阿尔兹海默症中差异表达基因与细胞焦亡数据库的交集韦恩图
(a)
(b)
(c)
(d)
图3 GO和KEGG top 10富集结果(从(a)，(b)，(c)，(d)依次是BP/CC/MF/KEGG)左侧是气泡图：纵坐标表示显著富集到的功能通路，横坐标表示该通路富集到的基因与总差异基因个数的占比，图中圆圈大小表示通路富集到的基因个数，圆圈越大表示富集到的基因个数越多，颜色表示P值，颜色越红表示P值越小。右侧为炫图：左半圈表示富集到的基因名称，右半圈是功能条目。
Figure 3. Bubble plot of functional enrichment analysis of pyroptosis-related genes in Alzheimer’s disease
图3. 阿尔兹海默症中细胞焦亡相关基因的功能富集分析气泡图
4. 讨论
目前，全球约有5500万人患有阿尔茨海默病，这一数字每5年翻一番[2]。值得强调的是，在欧洲国家进行的人口研究中，阿尔茨海默病患者比例从65至69岁患者组的0.6%上升到90岁及以上患者的22.2%，这进一步证实了全球阿尔茨海默病患病率的趋势[12]。大量研究和科学研究表明，炎症过程是阿尔茨海默病发展中最常见的机制[13]。包括星形胶质细胞、小胶质细胞以及细胞因子和趋化因子等蛋白质在内的一组细胞，会引起神经炎症，破坏神经元周围环境，导致神经元损伤，从而促进神经细胞的焦亡，进而出现阿尔茨海默病的症状[14]。
HSP90ab1即为热休克蛋白90α家族B类成员1，它作为伴护蛋白在淀粉样β和tau误折叠中起关键作用，而这是阿尔兹海默症发生的关键环节[15]。已有的研究指出晚期阿尔茨病组患者CA2区域的HSP90ab1面积分数显著增加，这可能阻止淀粉样蛋白β和tau聚集[15]。实际上它是一个预测性生物标志物，其调节异常与阿尔茨海默病病理中的多种事件有关，包括骨质疏松的促进、核苷酸代谢改变、微管稳定性以及血脑屏障功能障碍[16]。但是有趣的是很少有研究提出HSP90ab1与细胞焦亡有关。NLRP3富集于小胶质细胞[6]。它是细胞焦亡中经典且关键的焦亡小体。Tau是NLRP3上游信号的一部分，HSP90ab1等蛋白极有可能通过这一方法介入NLRP3的激活，并调控小胶质细胞的炎症与细胞焦亡[17]。HSPA8又名人类Hsp70亚型热休克相关蛋白71-kDa蛋白，也是伴护蛋白的一员，能与微管相关蛋白Tau衍生肽的相互作用[18]。HSPA8与CHIP形成的复合物与协同其他泛素化酶，促使高磷酸化的tau泛素化，从而抑制其对细胞的杀伤作用，从而抵抗阿尔兹海默症的发生[19]。HSPA8也被报道参与细胞焦亡，它可以激活NLRP3的泛素化加剧败血症相关肺损伤的细胞焦亡，而这一过程可以被SKP2抑制[20]。然而我们的研究第一次提出其可能参与了阿尔兹海默症相关的细胞焦亡。
图4为PPI网络图，其中线条代表它们之间的互作关系，右图中蓝色节点表示下调基因，红色节点表示上调基因，颜色深浅表示差异倍数，颜色越深表示差异倍数越大，节点大小表示连接度，节点越大表示连接度越高。
Figure 4. Grid of PPI interactions for all pyroptosis-related genes in AD
图4. 所有阿尔兹海默症中细胞焦亡相关基因的PPI互作网格图
图5为PPI网络图，其中线条代表它们之间的互作关系，颜色深浅表示差异倍数，颜色越深表示差异倍数越大，节点大小表示连接度，节点越大表示连接度越高。
Figure 5. Grid of PPI interactions of the top 10 scoring pyroptosis-related genes in AD
图5. 得分前10的阿尔兹海默症中细胞焦亡相关基因的PPI互作网格图
总之，我们筛选出10个与阿尔兹海默症中细胞焦亡相关的hub基因，并指出HSP90ab1和HSPA8可能意义重大。本研究存在一些局限性。目前我们并没有具体的机制研究探索候选基因在阿尔兹海默症中细胞焦亡的作用，例如在动物水平和细胞水平上论证这一点。我们目前在尝试构建阿尔兹海默症的动物模型，并进一步验证我们的结论。
NOTES
*共第一作者。
#通讯作者。