基于网络毒理学、分子对接技术探讨双酚A 对尿道下裂的作用机制

Investigating the Mechanism of Bisphenol A in Hypospadias Based on Network Toxicology and Molecular Docking

摘要: 目的：探索双酚A (Bisphenol A, BPA)毒性机制对防治尿道下裂的意义。方法：采用网络毒理学结合分子对接技术，通过PubChem、ChEMBL、GeneCards等数据库筛选BPA的作用靶点及尿道下裂相关靶点，利用韦恩图分析交集基因。构建蛋白质–蛋白质相互作用网络筛选核心靶点，并通过基因本体论和京都基因与基因组百科全书富集分析揭示通路机制。最后，利用AutoDock进行分子对接验证核心靶点与BPA的结合模式。结果：共筛选出36个BPA诱导尿道下裂的潜在靶点，其中ESR1、PPARG为核心靶点(结合能分别为−6.84 kcal/mol、−8.10 kcal/mol)。富集分析表明BPA通过内分泌抵抗、雌激素信号通路、MAPK信号通路、PI3K-AKT信号通路调控尿道下裂进程。分子对接证实BPA与核心靶点通过氢键和疏水作用稳定结合。结论：通过网络毒理学为BPA诱导尿道下裂的分子机制提供初步见解，ESR1和PPARG可能在BPA诱导尿道下裂中发挥关键作用，为环境毒物与疾病关联的机制探索提供新的方法学参考。

Abstract: Objective: To explore the significance of bisphenol A toxicity mechanisms for the prevention and treatment of hypospadias. Methods: Network toxicology and molecular docking techniques were used. Targets of BPA action and hypospadias-related targets were screened through databases such as PubChem, ChEMBL, and GeneCards. Intersecting genes were analyzed using a Venn diagram. A protein-protein interaction network was constructed to screen core targets, and the pathway mechanisms were elucidated through Gene Ontology and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes enrichment analyses. Finally, AutoDock was used for molecular docking to verify the binding modes between core targets and BPA. Results: A total of 36 potential targets for BPA-induced hypospadias were screened, with ESR1 and PPARG identified as core targets (binding energies of −6.84 kcal/mol and −8.10 kcal/mol, respectively). Enrichment analysis indicated that BPA regulates the progression of hypospadias through endocrine resistance, the estrogen signaling pathway, the MAPK signaling pathway, and the PI3K-AKT signaling pathway. Molecular docking confirmed that BPA stably binds to the core targets via hydrogen bonds and hydrophobic interactions. Conclusion: This study, using network toxicology, provides preliminary insights into the molecular mechanisms of BPA-induced hypospadias. ESR1 and PPARG may play key roles in BPA-induced hypospadias, offering a new methodological reference for exploring the mechanisms linking environmental toxins and diseases.

1. 引言

双酚A (Bisphenol A, BPA)作为一种典型的内分泌干扰物，广泛用于合成聚碳酸酯和环氧树脂等材料中，主要通过皮肤、消化道及呼吸道进入人体内，并在人体内蓄积潜伏，对人体造成伤害[1] [2]。BPA的化学结构类似于雌激素，具有微弱的雌激素活性和强大的抗雄激素活性[3]，因此BPA与许多内分泌疾病和男性发育异常相关[4]。动物研究表明，BPA可通过诱导线粒体自噬进而驱动铁死亡，破坏精子的产生[5]。在针对孕期小鼠的实验中证明，妊娠期BPA可通过调节雄性生殖细胞中DNA甲基化和组蛋白修饰进一步增强其精子功能和雄性生殖能力的抑制作用，并展示出多代抑制的可能[6]。流行病学研究显示，男性尿液BPA的总浓度与精子DNA损伤呈现正相关，具有较为明确的生殖毒性[7]。

尿道下裂是一种常见的先天性泌尿生殖系统畸形[8]，其全球发病率约为千分之二，近年来随着经济水平的提高，该病的发病率呈现上升趋势[9]。尿道下裂的临床表现为尿道开口异常，部分患儿可伴阴茎或包皮异常，按照尿道口开口位置可分为近端型、中间型和远端型[10]，当前手术治疗是该病唯一的治疗方式[11]。尿道下裂病因尚未明确，但研究表明，除遗传易感性外，环境暴露因素在该疾病的发生发展中发挥着重要作用。流行病学研究发现，孕期双酚类暴露与男性子代的肛门生殖器距离缩短存在关联，其尿道下裂的发病风险也相应升高[12]。在动物模型中，母鼠孕期暴露于BPA后，其雄性子代的尿道下裂等生殖器官发育异常的概率增加，进一步揭示了BPA可能对尿道下裂发生发展的影响[13]。尽管现有研究已经初步揭示了BPA与尿道下裂之间存在关联，但其参与该疾病发生发展的具体分子机制仍需进一步探索。

近年来，系统生物学领域的技术革新为解析毒物的毒理机制提供了创新研究范式。网络毒理学与分子对接的交叉应用，为阐明BPA与尿道下裂的分子机制提供了新路径。网络毒理学作为网络药理学的交叉学科方法，通过整合计算毒理学、系统生物学与网络分析方法，构建“毒物–靶点–疾病”多层互作网络，系统揭示环境毒物对生物体的有害效应机制，从而实现对环境毒物的多维度评估[14]。分子对接可预测化合物及靶标蛋白的结合模式与亲和力，从而在原子水平解析化学–生物相互作用的分子基础[15]。

本文采用网络毒理学与分子对接技术，对BPA、尿道下裂及其潜在靶点的关联进行探索性分析，初步评估BPA诱导尿道下裂的潜在毒性效应及其分子作用机制，为探索相关环境毒物暴露水平及其潜在危害提供理论依据。

2. 研究方法

2.1. BPA的靶点收集

在PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)输入关键词“双酚A (Bisphenol A)”进行搜索，收集化合物SMILE式，并下载为SDf文件。将BPA的SMILE式字符分别提交至Swiss Target Prediction平台(https://www.swisstargetprediction.ch)、ChEMBL数据库(https://www.ebi.ac.uk/chembl/)进行相关靶点预测，预测时将物种选为“智人”，以识别BPA作用于人体的潜在靶点。之后，将BPA的SMILE式提交至STITCH数据库(https://stitch-db.org)以扩大靶点覆盖范围。使用Perl计算机程序语言编写的脚本对活性成分和靶点进行对应筛选并去重，显示出药物靶标的名称和序号；在此基础上把药物成分名称通过UniProt (https://www.uniprot.org)数据库转化成基因标签，最后将各数据库的预测结果取并集进行整合与去重，最终构建成分靶点库。

2.2. 尿道下裂靶点和共同潜在靶点的收集

以“Hypospadia (智人)”为检索词，检索GeneCard (https://www.genecards.org)、OMIM (https://www.omim.org)、DrugBank (https://go.drugbank.com)等数据库，下载其疾病靶点并进行整合分析，构建尿道下裂靶点库。随后，使用R语言VennDiagram程序包对数据进行处理并做出Venn图，得到BPA-尿道下裂对应的数据。通过对药物靶点的筛选，发现36个潜在靶点，即BPA和尿道下裂的潜在靶点。

2.3. 蛋白质相互作用网络构建和确定核心靶点

将BPA诱导尿道下裂的潜在靶点信息导入String数据库中分析蛋白质–蛋白质间的相互作用。为确保构建相互作用网络的可靠性，参数设置如下：物种限定为“智人”；设置评分值(置信度) > 0.9 (高可信度)；错误发现率设置为高(1%)。

运用Cytoscape 3.10.3软件中的CytoHubba插件对连线结果进行富集和可视化分析，构建生成蛋白质–蛋白质互作网络图(PPI)。核心靶点的筛选条件：中介中心性(Betweenness Centrality) ≥ 中位数；紧密中心性(Closeness Centrality) ≥ 中位数；径向度(Radiality) ≥ 中位数；度中心性(Degree Value) ≥ 两倍中位数。

2.4. 基因本体注释及京都基因与基因组百科全书通路富集分析

基因本体(Gene Ontology, GO)分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)信号通路分析使用R语言BiocManager数据包对BPA和尿道下裂的潜在靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO分析将基因功能分为生物过程、细胞组成和分子功能三类，为明确BPA诱导的尿道下裂相关靶点的主要生物学功能提供系统注释。KEGG富集分析揭示了与BPA诱导的尿道下裂潜在靶点的相关通路。并利用R语言对GO分析和KEGG进行可视化分析。

2.5. 分子对接

目标蛋白及其相应配体的相应结构分别从UniProt数据库及PubChem数据库获得。经AutoDock Tool 1.5.6进行氢化和脱氢处理，然后将得到的结构进行保存，导出pdbqt格式。利用AutoDock Vina 1.2.7进行分子对接，并使用PyMOL 3.03进行可视化分析。

3. 结果

3.1. BPA诱导尿道下裂靶点的筛选

在PubChem数据库中输入关键词“双酚A (Bisphenol A, BPA)”进行搜索，获得BPA的SMILE式，如图1所示。从Swiss Target Prediction平台、STITCH数据库、ChEMBL数据库中筛选出133个BPA相关靶点。分别在GeneCard数据库、OMIM数据库、DrugBank数据库检索与尿道下裂发病机制相关的基因靶点，并对这些靶点进行整理和汇总，共筛选出与尿道下裂相关的5033个靶点。通过Venn图分析BPA与尿道下裂靶点的相关交集情况，共分析出36个共同靶点，如图2所示。

3.2. 潜在靶点的蛋白质相互作用网络的构建和核心靶点的筛选

利用String数据库对BPA与尿道下裂的共同靶点进行蛋白质相互作用网络的构建，如图2所示。通过Cytoscape软件中的CytoHubba插件对网络节点进行拓扑特征分析，包括度值和中位中心性等参数，节点的

Figure 1. Structure of Bisphenol A (BPA)

图1. BPA的结构

Figure 2. Venn diagram of BPA potentially inducing hypospadias

图2. BPA潜在诱导尿道下裂的韦恩图

大小和颜色决定相应基因的度值，度值越大，红色色调越深。ESR1、PPARG、BCL2、EGFR、MAPK3、ARKRAS、MAPK1等基因的度值较高，其节点较大，红色较深，如图3、图4所示。图5对相关核心靶点进行了可视化柱状图分析，基于度值排序，ESR1和PPARG最终被确定为BAP诱导尿道下裂的关键候选基因。

Figure 3. PPI network of BPA-induced hypospadias

图3. BPA诱导尿道下裂的PPI网络

Figure 4. Identification of core modules

图4. 核心模块的识别

Figure 5. Degree value analysis of core targets

图5. 核心靶点的度值分析

Figure 6. GO analysis of potential targets associated with BPA-induced hypospadias (bar chart)

图6. 与BPA诱导尿道下裂相关的潜在靶点的GO分析(柱状图)

3.3. GO分析

将上述潜在基因靶点进行GO分析，获得1046个生物过程(BP)，23个细胞组分(CC)，57个分子功能(MF)，按照FDR小于0.05对GO术语进行排序，采用统计柱状图(见图6)和气泡图(见图7)对FDR小于0.05的10个BP、CC、MF进行可视化呈现。GO分析显示，BPA诱导尿道下裂的相关靶点主要富集于肽酰–酪氨酸磷酸化、腺体发育、肽酰–酪氨酸修饰等生物学过程，膜阀、膜微、髓鞘等细胞组分，蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、配体转活的转录因子活性等分子功能。

Figure 7. GO analysis of potential targets associated with BPA-induced hypospadias (bubble plot)

图7. 与BPA诱导尿道下裂相关的潜在靶点的GO分析(气泡图)

3.4. KEGG富集分析

将上述潜在基因靶点进行KEGG富集分析，共获得128富集的信号通路，按照FDR小于0.05对KEGG通路进行排序，采用统计柱状图(见图8)和气泡图(见图9)对FDR小于0.05的34条KEGG信号通路进行可视化呈现。KEGG通路进一步显示，化学致癌作用–受体激活、内分泌抵抗、雌激素信号通路、MAPK信号通路、PI3K-AKT信号通路等34条信号通路与BPA诱导的尿道下裂存在显著关联。

3.5. 分子对接

通过软件AutoDock Vina 1.2.7进行分子对接，设置对接构象数为10个，选取对接结果中结合能(Binding Energy)数值绝对值最大的构象，然后利用PyMOL 3.03分析并作图。通过分子对接结果分析各小分子配体

Figure 8. KEGG enrichment analysis of potential targets associated with BPA-induced hypospadias (bar chart)

图8. 与BPA诱导尿道下裂相关的潜在靶点的KEGG富集分析(柱状图)

Figure 9. KEGG enrichment analysis of potential targets associated with BPA-induced hypospadias (bubble plot)

图9. 与BPA诱导尿道下裂相关的潜在靶标的KEGG富集分析(气泡图)

Figure 10. Molecular docking of BPA and ESR1

图10. BPA和ESR1分子对接

Figure 11. Molecular docking of BPA and PPARG

图11. BPA和PPARG分子对接

与各蛋白受体的结合能力强弱，一般认为，结合能绝对值越高，结合亲和力越高。结果显示，ESR1和PPARG分子对接结合能均低于−5 kcal/mol，其中ESR1的分子对接结合能为−6.84 kcal/mol (图10)，PPARG的分子对接结合能为−8.10 kcal/mol (图11)，提示BPA与关键靶点间可能具有良好结合活性。上述结果进一步表明，ESR1和PPARG作为BPA诱导尿道下裂的关键基因，对尿道下裂的发生发展发挥了作用。

4. 讨论

本研究综合运用网络毒理学与分子对接技术，首次系统性地构建了BPA诱导尿道下裂的相互作用网络。成功筛选出36个潜在交集靶点，并通过拓扑分析将ESR1、PPARG识别为核心靶点。分子对接进一步证实，BPA与这两个关键靶点均能形成稳定的结构。这些发现不仅从系统层面支持了BPA暴露与尿道下裂的关联，更揭示了其潜在作用机制。

ESR1又称雌激素受体1，作为雌激素受体的重要亚型之一，在调节生殖过程、骨骼形成和代谢中发挥关键作用[16]。流行病学研究显示，ESR1基因的特定单倍型在尿道下裂的患儿中较为常见，这提示ESR1可能作为遗传易感因素参与尿道下裂的疾病发生[17]。相关动物研究表明，ESR1敲除小鼠会出现轻度尿道下裂表型，这一证据证明ESR1在尿道正常形态发生中不可或缺[18]。尿道下裂的发生与尿道板成纤维细胞异常增殖与凋亡失衡密切相关[19]。有研究表明，ESR1异常激活后，会特异性调控线粒体自噬核心通路PINK1-Parkin信号轴，线粒体自噬增强会减少线粒体来源的活性氧蓄积，进而抑制脂质过氧化及铁死亡过程，同时调控铁丝网相关蛋白表达，进一步阻断铁死亡通路[20]。研究显示，铁死亡与早期胚胎发育、卵母细胞发育等过程相关[21] [22]。ESR1介导的铁死亡受到抑制会导致尿道板成纤维细胞的异常增殖，引发尿道开口异常、融合不全，形成尿道下裂。此外，通过KEGG富集分析，发现相关靶点富集于PI3K-AKT、MAPK等信号通路。这些通路在调控细胞增殖、存活与分化中发挥功能。BPA作为环境雌激素，可通过模拟雌二醇高亲和力结合ESR1并使其异常激活，促进生殖细胞的凋亡，导致间充质细胞行为失调，影响尿道版的形成，最终引发尿道融合障碍，促进尿道下裂的发生发展。

PPARG又称过氧化物酶体增殖物激活受体，作为一种配体激活的核受体，在脂质代谢、炎症反应、细胞增殖等多种生理过程中发挥核心调控作用[23]。本研究通过分析发现PPARG是具有高连接度且与BPA结合能极高的核心靶点，这可能是本研究最具创新的发现之一。既往研究证明，PPRAG可促进脂肪形成，动物实验表明PPARG可减少小胶质细胞的脂质积聚，促进伤口愈合[24]。近年来研究发现，环境毒物磷酸三苯酯可通过激活PPARG干扰胚胎正常发育，这为PPARG可能导致尿道下裂提供了一些理论基础[25]。一项动物研究发现，苯二甲酸单-2-乙基己酯可能通过核受体PPARG抑制MMP11的表达，促进尿道下裂的发生发展[26]。结合KEGG富集分析，BPA可能作为PPARG的非经典配体，异常调节其活性，从细胞外基质重塑、细胞增殖分化等多个层面干扰尿道生殖节区域细胞的正常生理行为，从而促进尿道下裂的发生发展。

5. 总结

综上所述，本研究基于网络毒理学、分子对接等网络模拟步骤，初步揭示了BPA诱导尿道下裂的潜在机制。结果显示，BPA可能通过ESR1、PPARG等关键靶点，调控雌激素信号通路、PI3K-AKT等相关信号通路，这些结果为阐明BPA诱导尿道下裂的发生机制提供了理论基础，为环境污染与尿道下裂之间提供了一定的干预措施。本研究是通过网络毒理学与分子对接等计算机模拟的方法进行预测的，尽管当前网络毒理与分子对接对BPA诱导尿道下裂提供了机制假说，但仍需要通过后续实验进行验证。这些发现为深入了解环境内分泌干扰物的复杂毒性机制提供了新的理论框架，并为针对性的生物标志物开发和风险预警提供了重要的候选靶点。

NOTES

^*通讯作者。