1. 引言
肺癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，2022年全球癌症统计报告显示，其在全球癌症死亡率中居首位，严重威胁着人类生命健康[1]。截至2022年，我国肺癌新发病例数约为106.06万，死亡病例数约73.33万，这两项数据在全部恶性肿瘤中均居首位[2]。由于肺癌具有高发病率和高致死率的特性，早诊早治对于改善患者预后尤为重要。因此探寻新的生物标志物为NSCLC的诊断和治疗提供新的线索具有重要意义。
突触结合蛋白7 (SYT7)作为突触结合蛋白家族中的一员，广泛存在于多种细胞的细胞膜上，在突触传递过程中发挥着重要作用，它能精准调节神经递质释放，使神经信号在突触间高效传递[3]。SYT7作为高亲和力的钙离子结合位点，可以感知微环境中钙离子浓度变化，其功能异常会影响神经递质和激素的释放，进而与多种疾病的发生发展密切相关[4]。许多研究已证明，SYT7在多种恶性肿瘤中表达异常并参与发生发展。在胃癌细胞中SYT7表达上调，并被证明是胃癌肝转移形成的驱动因子[5]。在头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)中SYT7通过激活促癌信号通路促进HNSCC细胞的增殖，同时调控BCL-2蛋白家族的表达来抑制细胞凋亡[6]。DONG等[7]研究显示，SYT7在甲状腺癌组织和细胞中均表达上调，并调控HMGB3泛素化从而促进甲状腺癌的进展。WANG等[8]研究发现，SYT7在结肠癌细胞中表达上调，并与细胞增殖、克隆形成、凋亡密切相关。但SYT7在肺癌组织中表达情况和临床意义还尚不清楚，本研究旨在探究SYT7在NSCLC患者癌组织及癌旁组织、NSCLC患者外周血及健康人外周血中的表达情况，并分析SYT7表达与NSCLC患者临床病理特征及预后的相关性。
2. 材料与方法
2.1. 研究对象
本研究收集了2019年11月至2022年11月来自承德医学院附属医院30例确诊肺癌患者的癌组织及对应的癌旁组织标本。血样样本选择同期确诊的51例NSCLC患者外周血及20例正常人外周血，其中新确诊病例外周血样本收集前未治疗肿瘤。纳入条件：① 初次确诊的患者，且在确诊后未接受放射治疗或药物治疗。② 患者不存在第二原发的恶性肿瘤病症。③ 患者具备详细的病历资料，涵盖了患者的性别、年龄、肿瘤具体大小、TNM分期、有无淋巴结转移、是否存在远处转移以及组织学类型等，并能获得患者的有效联系方式。④ 患者未患有严重的免疫缺陷疾病，同时心、脑、肾等脏器功能正常。排除条件：① 患有严重的心脏、肝脏、肾脏、脑等基础性疾病的患者。② 伴有严重感染性疾病、自身免疫疾病紊乱引发的疾病及精神方面疾病的患者。③ 病历资料不完整的患者。本研究已确保所参与研究的对象均知悉相关研究情况并签署知情同意书。同时，本研究已通过承德医学院附属医院伦理委员会的审核批准(伦理编号：CYFYLL2021236)。
2.2. 研究方法
1) 采用免疫组化染色法检测SYT7在组织中的分布及细胞定位，将石蜡包埋的组织标本切取成5 um厚的组织切片，然后80℃烤片30 min，使用二甲苯连续脱蜡2次，每次8 min，侵泡在乙醇梯度(100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇、75%乙醇)中各3 min脱二甲苯，PBS清洗3 min。使用柠檬酸钠修复液进行热抗原修复，自然冷却至室温后加SYT7一抗稀释液，4℃孵育过夜。37℃水浴箱中复温1 h，PBS冲洗5 min × 3次，加入二抗后在37℃水浴箱中孵育30 min，PBS洗5 min。采用DAB染色，苏木素复染，常规封片。最后显微镜下观察并拍照保存。
2) 采用ELISA法检测血清中SYT7蛋白的表达水平。首先将试剂及样本恢复至室温。设置标准孔和空白孔，将100 ul不同浓度的标准品加入相应的标准空，空白孔则添加100 μL的通用稀释液。封板后，在37℃水浴箱中孵育1 h。弃去孔内液体，甩干后在每孔中加入100 μL的酶标记抗体，37℃孵育1 h后弃液洗板3次。再将100 ul酶结合工作液加入至相应孔中，37℃孵育30 min后再次洗板5次。每个孔中加入90 μL的底物，封板后在37℃水浴箱中避光孵育15 min。取出酶标板，在各孔中直接加入50 μL的终止液，然后在酶标仪测量每孔在450 nm波长的OD值。
2.3. 评价标准
依据对样品吸光度值的结果，绘制对应的标准曲线，得到各样品相应的浓度。单位统一设定为ng/mL。按照样品中目标物质的表达水平进行排序，确定出样品弄得的中位数。参考过往相关文献提供的界定标准，将浓度测定值低于中位数的样本定义为低表达样本，浓度高于中位数的样本则被归类为高表达样本[9]。
2.4. 随访
本研究采用多途径随访方式，具体为依据住院病历系统、门诊系统及电话沟通的形式开展随访，规定随访截止时间为2023年11月30日，随访结束时间以患者死亡日期或末次随访日期为准。关键研究指标，无进展生存期(PFS)定义为自患者首次入组起始至肿瘤复发所历经的时间。总生存期(OS)则定义为患者确诊疾病之日起至患者死亡或者随访截至所历经的时间。在研究过程中，详细记录每位患者的无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)。
2.5. 统计学方法
本研究的数据使用SPSS 25.0统计软件处理，计数资料以%和n表示，采用χ2检验；计量资料以“x ± s”表示，采用独立样本t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
3. 结果
3.1. 纳入的NSCLC患者的临床资料
如表1所示，所收集51例外周血中，淋巴结转移16例，占比68.7%，病理类型以腺癌多见，占比56.9%。
Table 1. The clinical and pathological characteristics of 51 NSCLC peripheral blood patients [n (%)]
表1. 51例非小细胞肺癌患者外周血的临床病理特征[n (%)]
分类 |
n (%) |
性别 |
|
男 |
38 (74.5) |
女 |
13 (25.5) |
年龄 |
|
>60 |
26 (50.9) |
≤60 |
25 (49.1) |
肿瘤直径 |
|
>2 cm |
30 (58.8) |
≤2 cm |
21 (41.2) |
病理学分型 |
|
腺癌 |
29 (56.9) |
鳞癌 |
22 (43.1) |
T分期 |
|
T1~2 |
18 (35.3) |
T3~4 |
33 (64.7) |
淋巴结转移 |
|
有 |
35 (68.7) |
无 |
16 (31.3) |
远处转移 |
|
M0 |
13 (25.5) |
M1 |
38 (74.5) |
3.2. SYT7在NSCLC组织中高表达
本研究对纳入的30例肺癌组织和对应的癌旁组织进行免疫组化分析结果示：SYT7在癌组织中表达水平高于癌旁组织(P < 0.05) (见图1(A)~(D))；SYT7在不同癌组织中均高表达(见图2(A)~(C))。
(A)：SYT7在肺腺癌组织高表达(×200)；(B)：SYT7在肺腺癌癌旁组织低表达(×200)；(C)：SYT7在肺鳞癌组织高表达(×200)；(D)：SYT7在肺鳞癌癌旁组织低表达(×200)。
Figure 1. Expression of SYT7 in different types of NSCLC tumor tissues and adjacent normal tissues
图1. SYT7在不同类型NSCLC癌组织和癌旁组织中的表达情况
(A)：SYT7在NSCLC癌组织和癌旁组织表达差异；(B)：SYT7在肺鳞癌组织和癌旁组织表达差异；(C)：SYT7在肺腺癌组织和癌旁组织表达差异。
Figure 2. Expression of SYT7 in different types of NSCLC tumor tissues and adjacent normal tissues
图2. SYT7在不同类型NSCLC癌组织和癌旁组织的表达情况
3.3. SYT7在NSCLC患者外周血中高表达
本研究将收集的51例NSCLC患者和20例健康志愿者的外周血样本通过ELISA法检测SYT7蛋白的表达情况。结果显示，非小细胞肺癌患者外周血中SYT7的浓度为3.875 (ng/mL) (1.798, 7.258)，肺腺癌患者的浓度为3.870 (ng/mL) (2.313, 7.478)，肺鳞癌患者的浓度为2.929 (ng/mL) (0.909, 6.427)，健康志愿者外周血SYT7浓度为1.340 (ng/mL) (0.828, 2.726) (见图3(A)~(C))。
(A)：SYT7在NSCLC患者外周血高表达；(B)：SYT7在肺鳞癌患者外周血高表达；(C)：SYT7在肺腺癌患者外周血高表达。
Figure 3. Expression of SYT7 in serum of NSCLC patients and healthy controls
图3. SYT7在NSCLC患者和正常人血清中的表达情况
3.4. NSCLC患者外周血中SYT7表达水平与临床病理特征关系
依据评分标准对ELISA结果分析示，高表达组有24例，低表达组有27例。两组的肿瘤直径(χ2 = 4.897, P = 0.027)和淋巴结转移(χ2 = 4.554, P = 0.033)差异有统计学意义，两组的基线资料对比无统计学意义(P > 0.05) (见表2)。
3.5. 外周血中SYT7表达与NSCLC患者预后的关系
对收集外周血的患者进行电话随访，截止日期在2023年11月30日。结果显示，随访期间出现疾病进展的有22例，SYT7高表达组、低表达组分别为15、7例。随访期间有20例患者死亡，SYT7高表达组、低表达组分别有13、7例。生存分析结果示，SYT7高表达组的总生存期和无进展生存期均低于低表达组，表明SYT7高表达组患者的预后更差，差异有统计学意义(P < 0.05) (见图4(A)、图4(B))。
Table 2. Comparison of SYT7 expression levels in peripheral blood of 51 NSCLC patients with different clinical features [n (%)]
表2. 51例不同临床特征NSCLC患者外周血SYT7表达水平比较[n (%)]
分类 |
病例数n |
SYT7表达水平 |
χ2 |
P-value |
高表达 |
低表达 |
年龄 |
|
|
|
|
|
>60岁 |
26 |
12 (46.1) |
14 (53.9) |
0.017 |
0.895 |
≤60岁 |
25 |
12 (48.0) |
13 (52.0) |
性别 |
|
|
|
|
|
男 |
38 |
20 (52.6) |
18 (47.4) |
1.858 |
0.172 |
女 |
13 |
4 (30.7) |
9 (69.3) |
肿瘤直径 |
|
|
|
|
|
>2 cm |
30 |
18 (60.0) |
12 (40.0) |
4.897 |
0.027 |
≤2 cm |
21 |
6 (28.6) |
15 (71.4) |
病理学分型 |
|
|
|
|
|
腺癌 |
29 |
15 (51.7) |
14 (48.3) |
0.587 |
0.443 |
鳞癌 |
22 |
9 (40.9) |
13 (59.1) |
T分期 |
|
|
|
|
|
T1~2 |
18 |
7 (38.9) |
11 (61.1) |
0.745 |
0.388 |
T3~4 |
33 |
17 (51.5) |
16 (48.5) |
淋巴结转移 |
|
|
|
|
|
阴性 |
16 |
4 (25.0) |
12 (75.0) |
4.554 |
0.033 |
阳性 |
35 |
20 (57.1) |
15 (42.9) |
远处转移 |
|
|
|
|
|
M0 |
13 |
6 (46.2) |
7 (53.8) |
0.006 |
0.939 |
M1 |
38 |
18 (47.4) |
20 (52.6) |
(A)：总生存期对比；(B)：无进展生存期对比。
Figure 4. Survival curves of NSCLC patients with high and low expression of SYT7
图4. SYT7高低表达组的NSCLC患者的生存曲线
3.6. 影响NSCLC患者预后生存的单因素和多因素分析
将可能影响病人预后的因素带入COX回归模型，单因素和多因素结果证明，非小细胞肺癌患者的总生存期与SYT7的表达量、肿瘤直径、淋巴结转移具有显著相关性(P < 0.05)，而与患者的性别、年龄、病理学分型、T分期、有无远处转移等无相关性(P > 0.05)。这说明了SYT7的表达量、肿瘤直径、淋巴结转移是影响非小细胞肺癌患者OS的独立预后因素(见表3)。
Table 3. Univariate and multivariate Cox survival analyses between SYT7 and clinicopathological features
表3. SYT7与临床病理特征之间的单因素和多因素Cox回归分析
分类 |
单因素分析 |
多因素分析 |
HR (95% CI) |
P-value |
HR (95% CI) |
P-value |
年龄 |
0.707 (0.883~1.966) |
0.436 |
|
|
性别 |
0.902 (0.694~2.539) |
0.512 |
|
|
肿瘤直径 |
1.821 (1.042~3.237) |
0.039 |
1.904 (1.107~3.491) |
0.031 |
病理学分型 |
1.528 (0.528~4.422) |
0.434 |
|
|
T分期 |
1.792 (0.431~2.966) |
0.290 |
|
|
淋巴结转移 |
2.147 (1.562~4.432) |
0.012 |
2.832 (1.326~4.892) |
0.002 |
远处转移 |
1.092 (0.489~2.227) |
0.762 |
|
|
SYT7 |
1.403 (1.169~2.981) |
0.045 |
1.537 (1.173~3.376) |
0.043 |
4. 讨论
NSCLC约占肺癌的80%~85%，其中约30%非小细胞肺癌患者在诊断时已处于晚期，大多已失去了最佳手术治疗手段[10]。尽管放疗、药物治疗等手段在肺癌治疗中应用广泛，然而肺癌治疗耐药性等特征，使治疗最终失败[11]。所以，深入探究肺癌发生发展的分子机制，不仅对肺癌的早期筛查有重要意义，而且有助于发掘治疗靶点。
近年研究表明，突触蛋白7 (SYT7)在上皮性卵巢癌[12]、鼻咽癌[13]、宫颈鳞状细胞癌[14]等多种恶性肿瘤中高表达，并通过多种信号通路促进肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭，进而促进肿瘤的发生发展。但SYT7表达差异在NSCLC组织和外周血中的临床价值还不明确。
在本研究中，我们证实了SYT7在肺腺癌、肺鳞癌癌组织中表达水平均上调，同时证明了SYT7在NSCLC患者外周血中的表达水平显著高于健康志愿者，并与NSCLC患者不良预后相关。其差异均有统计学意义。
本研究通过对SYT7在非小细胞肺癌患者的外周血的表达水平与收集的临床特征进行分析发现了，SYT7在非小细胞肺癌患者外周血的表达与肿瘤直径和淋巴结转移有相关性。生存分析结果显示，相较于SYT7低表达组，SYT7高表达组的无进展生存期和总生存期均呈下降。通过Cox单因素回归分析发现非小细胞的肺癌患者的总生存期与肿瘤直径大小、是否有淋巴结转移以及SYT7高表达相关，进一步开展多因素回归分析后发现肿瘤直径、淋巴结转移及SYT7高表达是非小细胞肺癌患者预后不佳的独立危险因素。基于上述结果，我们可以明确SYT7的表达水平会对非小细胞肺癌患者的预后产生显著影响。
此外，本研究还存在一定的不足，首先我们研究分析的免疫组化样本量偏小，这可能会对研究结果产生一定影响，将来需要扩大样本量的数目来进一步证实我们的研究结果。而且，在对非小细胞肺癌癌组织样本结果进行分析时采用的是半定量评定标准，这可能会存在统计方面的偏差。
结合前文，通过检测临床组织和血液标本，本研究发现在非小细胞肺癌患者癌组织及外周血中SYT7均呈高表达并与患者预后相关。未来可进一步探索SYT7在NSCLC进展中的作用及潜在分子机制，为开发靶向SYT7的治疗提供依据。
NOTES
*共同一作。
#通讯作者。