黑色素瘤中的细胞焦亡机制及其潜在治疗策略

The Mechanism of Cell Pyroptosis in Melanoma and Potential Therapeutic Strategies

摘要: 焦亡是由Gasdermins蛋白家族介导的程序性细胞死亡，其执行机制依赖于caspase-1或caspase-4/5/11对Gasdermin D (GSDMD)的特异性切割。该切割导致GSDMD的N端成孔结构域(PFD)与C端阻遏结构域(RD)分离，进而形成膜穿孔，最终介导细胞死亡。PFD寡聚化在膜中形成大孔，从而驱动溶胀和膜破裂。细胞焦亡在免疫反应中起着重要作用，但过度激活可能与多种疾病的发生相关，如感染、自身免疫疾病和肿瘤。黑色素瘤的发病率在世界范围内迅速增加，不仅是男性第五大最常见的癌症类型之一，也是女性第六大最常见的癌症类型之一，成为一个严重的公共卫生问题。近年来的研究发现，焦亡在黑色素瘤的发生及发展中发挥着关键作用，靶向促进细胞焦亡的药物在黑色素瘤的治疗中具有巨大潜力。本文讨论了焦亡的概念和调控机制、焦亡在黑色素瘤中的作用及其机制以及靶向黑色素瘤的潜在治疗价值。

Abstract: Pyroptosis is a programmed cell death mediated by the Gasdermins protein family, and its execution mechanism depends on the specific cleavage of Gasdermin D (GSDMD) by caspase-1 or caspase-4/5/11. This cleavage results in the separation of the N-terminal pore-forming domain (PFD) from the C-terminal repressor domain (RD) of GSDMD, which subsequently forms a membrane perforation and ultimately mediates cell death. PFD oligomerization forms macropores in the membrane, which drives swelling and membrane rupture. Pyroptosis plays an important role in the immune response, but excessive activation may be associated with the occurrence of a variety of diseases, such as infections, autoimmune diseases, and tumors. The incidence of melanoma is rapidly increasing worldwide, becoming not only the fifth most common type of cancer in men but also the sixth most common type of cancer in women, posing a serious public health problem. Recent studies have found that pyroptosis plays a key role in the occurrence and development of melanoma, and drugs targeting pyroptosis have great potential in the treatment of melanoma. This review discusses the concept and regulatory mechanism of pyroptosis, the role and mechanism of pyroptosis in melanoma, and the potential therapeutic value of targeting melanoma.

1. 引言

黑色素瘤是一种由黑色素细胞起源的恶性肿瘤。黑色素细胞是产生黑色素的细胞，主要存在于皮肤中，但也存在于眼睛、耳朵、软脑膜、胃肠道以及口腔、生殖器和鼻窦粘膜中[1]。由于近年来自然阳光和室内的紫外线辐射暴露，皮肤黑色素瘤(Cutaneous Melanoma, CM)的发病率在全球稳步上升[2]-[4]。CM是基因突变逐步积累的结果，这些基因突变改变了细胞增殖、分化和死亡。另外，遗传也是黑色素瘤发病的一个重要原因[5]-[7]。黑色素瘤根据其形成途径可划分为浅表扩散性黑色素瘤(低累积性阳光损伤黑色素瘤)和恶性雀斑样斑黑色素瘤(高累积性阳光损伤黑色素瘤) [8]。原发性黑色素瘤通常通过广泛切除(有时称为具有安全边际的切除)进行治疗[9]，恶性雀斑痣进行非手术处理[10]。但对于一些晚期的黑色素瘤患者，通常采用化疗、免疫治疗或靶向治疗[11] [12]。然而，当前黑色素瘤的化疗效果有限，主要因为其抗药性和毒性较大，且无法有效靶向肿瘤细胞。虽然免疫治疗和靶向治疗在部分患者中取得了显著效果，但仍面临耐药性发展、疗效不稳定以及副作用等挑战[13]-[15]。因此，迫切需要开发新的靶向药物用来治疗黑色素瘤。

焦亡(Pyroptosis)是近年来被发现的一种程序性细胞死亡，由Gasdermins蛋白家族介导[16] [17]，由炎症小体激活引发，并伴随着caspase-1或caspase-4/5/11的激活，特异性切割GSDMD，分离PFD和RD。PFD寡聚化在膜中形成大孔，从而驱动溶胀和膜破裂[18]。细胞焦亡在免疫反应中起着重要作用，但过度激活可能与多种疾病的发生相关，如感染、自身免疫疾病和肿瘤[19]-[21]。近年来的研究表明，焦亡在黑色素瘤的发生及发展中发挥着关键作用，靶向促进细胞焦亡的药物在黑色素瘤的治疗中具有巨大潜力。

2. 焦亡

焦亡首次发现于感染肠道鼠伤寒沙门氏菌血清型的巨噬细胞[22]。早期研究观察到细胞死亡伴随染色质浓缩和DNA片段化，曾将其归类为凋亡的亚型。直到1998年，Hilbi团队发现，这种细菌诱导的细胞死亡严重依赖于caspase-1，才正式确立其作为程序性细胞死亡新类别的地位[23]。其与凋亡的核心区别在于：在保持核膜结构的同时发生线粒体膜电势崩溃以及细胞肿胀至正常体积的2~3倍后发生渗透性裂解[24]。焦亡的分子机制由GSDM蛋白家族控制，当病原体相关分子模式(PAMP)或损伤相关分子模式(DAMP)结合后，caspase介导的GSDM蛋白激活将会导致细胞凋亡[25]。同时，caspase通过促进促炎细胞的生成，引发或延续炎症反应。在肿瘤生物学中，焦亡的双重效应影响着疾病的进展。一方面，焦亡通过诱导肿瘤细胞死亡和释放免疫刺激因子来抑制肿瘤生长，另一方面，持续的焦亡反应可能导致免疫抑制性微环境的形成，促进肿瘤进展。这种双重性使得癌细胞能够根据微环境条件动态调节焦亡通路，例如通过表观遗传机制下调GSDM家族基因表达以逃避死亡，或通过激活特定caspase以重塑肿瘤微环境。

目前的研究已明确焦亡存在多条调控通路，包括两类核心和若干补充机制。核心途径由GSDMD诱导，涉及炎性caspase-1 (经典途径)或caspase-4/5 (或小鼠caspase-11) (非经典途径)。在补充机制中，讨论最为广泛的是caspase-3可通过切割GSDME触发焦亡[26]。也有相关研究涉及其他GSDM家族成员和caspase或颗粒酶的不同途径。在结构上，GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD和GSDME均具有成孔活性的N端区域和发挥自抑制作用的C端区域两个关键功能域，二者通过柔性连接区相连[27]。在静息状态下，C端结构域通过空间位阻效应抑制N端活性。然而，当caspase或颗粒酶在连接区进行特异性切割后，N端结构域得以释放并转位至细胞膜系统，通过寡聚化形成跨膜孔道，最终导致炎症因子(如IL-1β和IL-18)释放和细胞渗透性溶解。

2.1. 经典的炎性小体通路

在经典炎症小体介导的焦亡通路中，模式识别受体(PRR)通过识别损伤相关分子模式(DAMP，如纤维蛋白原、热休克蛋白和DNA)和/或病原体相关分子模式(PAMP，如鞭毛蛋白、聚糖和脂多糖)，触发胞质内炎症小体复合物的组装，该复合物由传感器蛋白、接头蛋白和效应半胱天冬酶共同组成[28]。虽然多种PRR，(如NOD样受体(NLR)和Toll样受体(TLR))参与了这一过程，但仅有部分特定亚群可直接介导炎性小体组成并激活caspase-1。具体来说，特定的PRR传感器主要包括pyrin结构域的NLR家族(NLRP1, NLRP3, NLRP4)以及AIM2和Pyrin。他们识别到相应的危险信号(如DAMP或PAMP)后发生构象变化，通过接头蛋白(ASC)募集pro-caspase-1并通过ASC的CARD结构域与pro-caspase-1的CARD结构域相互作用，形成多聚体复合物，进而通过自切割生成具有催化活性的caspase-1。活化后的caspase-1具有双重功能，一方面，通过切割GSDMD释放其N端成孔结构域，另一方面，将pro-IL-1β和pro-IL-18加工为成熟形式，通过GSDMD-N在细胞膜上形成的孔道释放到胞外，该过程伴随K+外流、Na⁺/Ca2⁺内流等离子梯度改变，最终导致细胞渗透性溶解和焦亡的发生[29]。

2.2. 非经典炎性小体通路

非经典炎症小体通路与经典途径的关键区别在于其不依赖caspase-1，而是由caspase-4/5 (人类)或caspase-11 (小鼠)直接介导。这些caspase的激活通过直接结合革兰氏阴性菌来源的LPS实现而不需要炎性小体传感器的参与。尽管caspase不能直接激活IL-1β和IL-18，但可通过GSDMD切割触发细胞焦亡，导致K+外流，通过离子梯度变化进一步激活NLRP3炎性小体，并增强caspase-1的活性及其下游炎症反应[30]。此种级联反应机制协同了非经典途径和经典途径，共同调控炎症信号的放大。

2.3. 其他途径

除经典和非经典途径外，研究还揭示了多种替代性焦亡通路。在化疗或靶向癌症治疗等一些特定条件下，caspase-3可通过切割GSDME将细胞死亡方式从凋亡转变为焦亡。caspase-3不仅与细胞凋亡的执行有关，还可通过GSDME的裂解介导细胞焦亡，从而导致GSDME-N端成孔结构域释放并在细胞膜上形成孔道，引起膜通透性改变。相关研究表明，GSDM蛋白的表达水平在调控细胞死亡方式中起着关键作用，当其高表达时，caspase-3激活后会迅速诱导焦亡，但当其低表达时，则主要引发凋亡[31]，这一现象揭示GSDM蛋白家族的表达水平可能是决定细胞焦亡或凋亡的关键分子开关，但相关机制仍需进一步验证。目前，部分研究还揭示了多种替代性焦亡途径，包括caspase-8介导的GSDMD切割[32]、caspase-8介导的GSDME切割[33]、颗粒酶B (GzmB)与caspase-1介导的GSDMB切割[34]或颗粒酶A (GzmA) [35]与caspase-8介导的GSDMC切割以及缺氧激活的程序性死亡配体1 (PD-L1)和pSTAT3的转录上调和GSDMA孔的形成[36]，前述发现扩展了焦亡的调控网络，揭示了其在免疫监视和肿瘤微环境中的复杂作用，但具体分子机制仍有待深入研究。

3. 焦亡在黑色素瘤中的作用及机制

焦亡作为一种近年来被广泛研究的程序性细胞死亡形式，在黑色素瘤的发生和发展中发挥着作用。有诸多研究发现，焦亡相关的基因表达与黑色素瘤患者的预后相关。例如，Wu Z等人从癌症基因组图谱(TCGA)下载了黑色素患者的基因谱和临床数据，以识别与细胞焦亡和总生存期(OS)相关的差异表达基因。并使用LASSO分析构建预后基因特征，然后应用免疫细胞浸润评分和Kaplan-Meier、Cox和通路富集分析来确定基因特征在黑色素中的作用。从基因表达综合(GEO)数据库中收集验证队列。结果发现与焦亡相关基因与患者生存相关，并与肿瘤生长和转移相关。并且风险特征的基因集富集分析结果表明，几种富集途径与癌症和免疫有关。另外，免疫状态的风险特征与肿瘤干细胞、免疫微环境、免疫细胞浸润和免疫亚型显著相关。最后，他们的研究还发现焦亡基因的表达与黑色素瘤患者的OS显著相关，并且与癌细胞对几种抗肿瘤药物的敏感性有关[37]。上述发现说明了焦亡在黑色素瘤的发生及发展中发挥了作用，可能是通过调节了肿瘤免疫微环境从而发挥作用的(这也和焦亡导致细胞膜破裂后释放细胞因子的机制相呼应)。另外，一些抗肿瘤药物也可能通过促进肿瘤焦亡从而发挥抗肿瘤作用。与之类似，Zhou B团队也通过对RNA测序数据的生物信息学分析检查了细胞焦亡与黑色素瘤预后之间的关系。结果发现，焦亡是与黑色素瘤预后相关的保护因素。此外，他们也分析了焦亡在肿瘤免疫微环境和药物反应中的潜在作用。但他们的结果相较于Wu Z团队，进一步发现了多种免疫细胞(如CD4⁺ T\CD8⁺ T、树突状细胞和M1巨噬细胞)的浸润增加可能与焦亡的发生有关。另外，该研究还发现焦亡的发生与黑色素瘤对干扰素-α (IFN-α)、紫杉醇、顺铂和伊马替尼的治疗敏感性增强相关。为进一步验证这一现象，研究者通过分析癌症药物敏感性基因组学数据库，对12个焦亡相关基因与135种化疗药物的关联性进行了Spearman相关性分析。结果表明，溶质载体家族31成员2 (SLC31A2)和胶原4型α5链(COL4A5)在此过程中发挥关键作用[38]。与此同时，另一研究发现8个与预后相关的焦亡相关lncRNAs可用于建立风险模型，且低风险组黑色素瘤患者总生存率较高，进一步证实了焦亡与黑色素瘤的关联[39]。在既往的研究中发现，焦亡发挥对肿瘤的调控作用很可能是通过影响肿瘤免疫微环境从而实现的，故也有研究探讨了焦亡相关lncRNAs指示肿瘤免疫微环境的作用。ZHONG J等人构建了一个基于焦亡相关的lncRNAs模型，结果发现该模型可有效预测黑色素瘤的预后。并且发现与高危组相比，低风险组通常具有更高的抗肿瘤免疫水平。该特征与自噬/铁死亡相关基因和PD1/PD-L1基因的表达和肿瘤突变负荷相关，表明了焦亡相关的lncRNAs可以指示肿瘤免疫微环境并且可以用于预测黑色素瘤的预后[40]。类似的研究还有很多，大多都是得到同一个结论，即：焦亡相关的基因可以用于预测黑色素瘤的预后。这说明焦亡在黑色素瘤的进展中发挥了重要作用[41]-[50]。

另外，也有诸多研究人员将目光放到了焦亡调控黑色素瘤发生发展的具体机制中。例如，Rosenbaum SR等人的研究发现转录因子SOX10可以促进黑色素瘤细胞增殖和肿瘤形成。他们探讨了SOX10的作用是否会与T细胞分泌的细胞因子TNFα和IFNγ相关，结果发现SOX10的遗传消融会使黑色素瘤细胞对CD8⁺T细胞介导的杀伤和TNFα或IFNγ诱导的细胞死亡更敏感，并且与caspase依赖性焦亡的特征有关。这说明，SOX10是通过调控黑色素瘤焦亡从而发挥其抑癌作用的[51]。Zeng B等人发现高度转移性黑色素瘤肿瘤细胞可以通过外泌体miR-211-5p将其转移能力转移到低转移性黑色素瘤肿瘤细胞。miR-211-5p的致癌活性是由靶基因鸟嘌呤核苷酸结合蛋白亚基alpha-15 (GNA15)通过外在修饰肿瘤微环境的免疫功能介导，并且还能抑制细胞焦亡，从而调控肿瘤的增殖。此外，他们的研究表明miR-211-5p的外泌体分泌具有选择性，受miR-211-5p和含有26 (ZFYVE26)的锌指FYVE型之间的转录反馈回路的调节。通过外泌体调控焦亡，在高度转移性黑色素瘤细胞将其转移能力转移到低转移性黑色素瘤肿瘤细胞中发挥了重要作用[52]。值得注意的是，焦亡在黑色素瘤中的作用具有双重性，其具体效应与微环境密切相关。例如，BRAF突变(常见于黑色素瘤)可能通过MAPK/ERK信号通路的持续激活，抑制GSDM家族蛋白(如GSDME)的转录或促进其降解，从而帮助肿瘤细胞抵抗焦亡，维持存活。而一旦焦亡被过度或不适当地诱导，释放的大量炎症因子(如IL-1β、IL-18及HMGB1)可能募集髓源性抑制细胞(MDSCs)或M2型巨噬细胞，形成免疫抑制性微环境，从而促进肿瘤生长、血管生成及远处转移。因此，区分“免疫原性焦亡”(释放免疫刺激信号，激活抗肿瘤免疫)与“促肿瘤炎症”(引发慢性炎症、免疫抑制和基质重塑)至关重要，这解释了为什么并非所有焦亡都对黑色素瘤患者有益。

4. 靶向焦亡在黑色素瘤中的临床应用

虽然，当前并无靶向焦亡的药物用于临床。但是，在临床前研究中，已有诸多实验表明，某些靶向凋亡的药物可以有效地抑制黑色素瘤的进展。例如，Wang S等人将载有雷公藤甲素的纳米颗粒作用于黑色素瘤细胞，结果发现纳米颗粒可以触发Fenton反应并导致活性氧(ROS)产生，并且可以促进焦亡，释放大量DAMP，刺激树突状细胞的抗原呈递和细胞毒性T淋巴细胞(CD4⁺/CD8⁺ T细胞)的增殖，以抑制肿瘤增殖和肺转移[53]。Ren H团队采用类似策略构建了纳米颗粒，但其负载的是组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂联合谷氨酰胺代谢抑制剂。研究显示，该纳米颗粒可诱导黑色素瘤细胞发生致命性活性氧(ROS)爆发，进而触发细胞焦亡。当与程序性细胞死亡蛋白1单克隆抗体(α-PD-1)联合使用时，可促进免疫细胞浸润，提高抗肿瘤免疫力，将“免疫感冒”肿瘤转化为“免疫热”肿瘤[54]。虽然他们的研究表明了构建的纳米颗粒可以诱导焦亡的发生，但是，HDAC抑制剂是如何调控焦亡的并未阐述。而且，当前也并无研究表明组蛋白乙酰化修饰对黑色素瘤细胞的焦亡有何作用。因此，还需要更多研究进行验证。同样，Zhang MJ等人将BRAF和COX2抑制剂处理黑色素瘤细胞，结果发现可以导致肿瘤细胞焦亡[55]。但COX2与BRAF是如何调控焦亡的，既往并无研究进行证明。从机制上推测，BRAF抑制剂可能通过阻断MAPK信号，解除其对GSDM家族基因表达的抑制，从而恢复焦亡敏感性；而COX2抑制剂可能通过减少PGE2等炎症介质，调节caspase活化或GSDM切割的微环境。也有研究发现caspase-3激活剂Raptinal在人和小鼠黑色素瘤细胞系模型中诱导细胞焦亡并延迟体内肿瘤生长。此外，Raptinal刺激了对BRAF和MEK抑制剂治疗产生耐药性的黑色素瘤模型的细胞焦亡[56]。这说明靶向促进焦亡的发生不仅可以用于黑色素瘤的初次治疗，也能对于已耐药的黑色素瘤细胞发挥抗肿瘤作用。

5. 结论与展望

焦亡作为一种重要的程序性细胞死亡形式，近年来在癌症研究中的地位日益突出，尤其在黑色素瘤的发生与发展过程中发挥了关键作用。研究表明，焦亡可以预测黑色素瘤的预后，调节黑色素瘤的进展。并且其调控机制可能通过影响肿瘤免疫微环境，进一步促进或抑制肿瘤的进展。因此，靶向焦亡的治疗策略有望成为黑色素瘤治疗的新手段。

目前，虽然并无靶向焦亡的药物进入临床应用，但诸多研究已证明通过诱导细胞焦亡可以有效抑制黑色素瘤的生长和转移。例如，利用caspase激活剂可以触发焦亡并提升肿瘤的免疫反应，成为抗肿瘤治疗的潜在策略。尽管这些研究结果具有重要意义，但由于焦亡在黑色素瘤中的具体调控作用机制仍然不甚清楚，需要进一步的探索和验证。

未来的研究应聚焦于以下几个方面：首先，深入探索焦亡在黑色素瘤中的分子机制，尤其是焦亡如何通过调控免疫微环境影响肿瘤进展。必须客观认识到，焦亡诱导的炎症微环境具有双重性：适度的免疫原性焦亡可激活抗肿瘤免疫，但持续或过度的炎症反应可能募集免疫抑制细胞、促进血管生成和基质重塑，从而加速肿瘤进展和转移。因此，区分并精确调控“有益”与“有害”的焦亡相关炎症是未来治疗策略的关键。其次，进一步明确靶向焦亡的药物作用机制，尤其是在肿瘤细胞的焦亡与其他细胞死亡方式(如凋亡)之间的平衡调节。尤其需要阐明为什么黑色素瘤细胞会对焦亡产生抵抗？这可能涉及GSDM家族基因的表观遗传沉默、BRAF/MAPK信号对GSDM表达的抑制、或细胞自噬/修复机制的上调。例如，BRAF V600E突变可能通过激活MEK/ERK通路抑制GSDME转录，从而降低焦亡敏感性；而恢复GSDME表达或联合MAPK抑制剂可能重新敏化肿瘤细胞。与此同时，研究应进一步验证现有靶向焦亡药物的安全性和疗效，推动其临床应用，为黑色素瘤患者提供新的治疗方案。

总之，靶向焦亡的策略在黑色素瘤的治疗中展示出巨大潜力，未来的研究将有助于优化现有治疗方法并为临床提供新的治疗思路。