液体活检技术在肝细胞癌早期诊断中的 研究进展

Research Progress of Liquid Biopsy Technology in the Early Diagnosis of Hepatocellular Carcinoma

摘要: 肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。其起病隐匿，早期无明显症状，就诊时多数已为疾病中晚期，其预后不良。腹部彩超和甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)作为传统的筛检手段，诊断早期肝细胞癌的灵敏度及特异度低，因此如何早期诊断肝细胞癌一直是研究热点。液体活检技术(Liquid biopsy)是一种新兴的非侵入性检测技术，通过分析体液中生物标志物，如细胞外游离核酸、细胞外囊泡、循环肿瘤细胞、肿瘤诱导血小板等，为肝细胞癌早期诊断及临床预测提供了新途径。本文就液体活检技术在肝细胞癌早期诊断中的研究成果进行综述，旨在为HCC早期精准诊断提供参考。

Abstract: Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the malignant tumors with the highest incidence and mortality rates. Its onset is insidious, with no obvious symptoms in the early stage, making it impossible to achieve effective early diagnosis and resulting in a poor prognosis. Abdominal Doppler ultrasound and alpha-fetoprotein (AFP), as traditional screening methods, have low sensitivity and specificity in diagnosing early hepatocellular carcinoma. Therefore, how to diagnose hepatocellular carcinoma at an early stage has always been a research hotspot. Liquid biopsy is an emerging non-invasive detection technique. By analyzing biomarkers in body fluids, such as cell-free nucleic acids, extracellular vesicles, circulating tumor cells, and tumor-educated platelets, it provides a new approach for the early diagnosis and clinical prediction of hepatocellular carcinoma. This article reviews the research achievements of liquid biopsy technology in the early diagnosis of hepatocellular carcinoma, aiming to provide a reference for the early and precise diagnosis of HCC.

1. 背景

肝癌是全球六大常见的恶性肿瘤之一，其预后差，居全球恶性肿瘤死因第4位[1]。由于肝癌早期隐匿性强，相关标志物的准确性有限，约70%的患者就诊时已为疾病中晚期，其5年生存率仅为12.1% [2]。有数据分析发现从1988年到2015年，美国肝细胞癌患者的生存率显著提高，这可能归功于早期诊断和治疗方法的进步[3]。因此针对肝癌的早期筛查和预防是改善肝细胞癌患者预后的关键。

目前肝细胞癌检测方法，如甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)、甲胎蛋白异质体(alpha-fetoprotein variant L3, AFP-L3)、异常凝血酶原(protein induced by vitamin K absence-II, PIVKA II)和超声等，均不能可靠地检测早期HCC [4]。一项meta分析表明，超声对于早期HCC检测的敏感性仅为27.3% [5]。超声检查在检测小于2 cm的早期肿瘤方面也存在局限性，其准确性在很大程度上依赖于操作者的熟练程度[6]。超声成像结果的质量也会受到患者的影响，在肥胖患者或NAFLD患者中可能会导致假阳性或不确定结果。另外HCC中AFP表达的阳性率仅约70%，且AFP经常在活动性肝炎、生殖系统肿瘤患者和妊娠妇女中出现假阳性[7]。有研究发现，与单一生物标志物相比，PIVKA-II与AFP组合可提高HCC的诊断率。结合两种生物标志物可提高检测早期HCC的灵敏度，但降低了特异度[8]。一项meta分析也发现AFP-L3对于诊断早期HCC虽具有较高的特异性(92%)，但敏感性(34%)较低[9]。这预示着AFP-L3也不适合用于早期HCC的一线筛查。因此，迫切需要发现既敏感性较高又特异性较高的生物标志物，以实现对HCC的早期检测。

液体活检技术是一种基于体液的非侵入性方式检测生物标志物的技术，在肿瘤患者的早期诊断、疗效监测、预后预测等方面显示出了巨大潜力。图1直观呈现了肝细胞癌早期诊断研究中常见液体活检生物标志物(包括细胞外游离核酸、细胞外囊泡、循环肿瘤细胞和肿瘤诱导血小板)的来源及检测方法。本文将对相关生物标志物在肝细胞癌早期诊断中的研究现状做出系统阐述。

2. 细胞外游离核酸(Cell-Free Nucleic Acids, cfNAs)

人类外周血中的细胞外游离核酸，包括细胞外游离DNA (cell-free DNA, cf-DNA)和细胞外游离RNA (cell-free RNA, cf-RNA)，可来源于不同组织的细胞的凋亡、坏死和主动分泌[10]。cf-DNA可以检测到肿瘤细胞的遗传学改变(包括突变、拷贝数变化和甲基化改变)，显示出良好的肝癌筛查和监测性能。cf-DNA包括正常细胞和肿瘤细胞释放的DNA，而循环肿瘤DNA (circulating tumor DNA, ctDNA)只是cf-DNA的一部分，只包括肿瘤细胞释放的DNA。与cf-DNA相比，cf-RNA所揭示的基因表达差异提供了许多疾病状态的信息，疾病特异性转录物的过表达可能导致血液中疾病源性cf-RNA信号的放大，这表明cf-RNA同样具有在临床诊断各种疾病中的应用潜力。

DNA甲基化是一种表观遗传现象，可以改变基因的表达，在癌症发生中尤为重要。有研究证实基于甲基化位点的生物标志物，不仅可用于诊断原发性肝癌，还可用于区分HCC和ICC [11]。2022年美国临床肿瘤学会报道了一种基于血液的ctDNA甲基化检测方法HepaQ，它以高灵敏度和高特异性对早期HCC显示出优异的诊断性能(敏感性为85.2%) [12]。一项研究发现环指蛋白135 (ring finger protein 135, RNF135)和乳酸脱氢酶B (lactic dehydrogenase B, LDHB)是普遍适用的HCC甲基化标记物，通过甲基化敏感高分辨率熔解(MS-HRM)分析发现，联合RNF135和LDHB的MS-HRM分析检测HCC的敏感性是57%，优于AFP检测的敏感性，并且具有相当的特异性，与AFP检测联合应用可以将诊断HCC的敏感性提高到70% [13]。目前，已确认在血浆中存在肿瘤来源的cf-mRNA，可用于癌症检测、肿瘤组织来源预测和癌症亚型确定[14]。除了cf-mRNA外，cf-lncRNA和cf-miRNA也可作为肝细胞癌诊断和生存预测的潜在新型生物标志物。

cfNAs是基于现代分子生物学技术和机器学习技术的液体活检方法，可以反映HCC的基因组和表观遗传特征，具有更高的敏感性和特异性，以及更多的功能性。但目前仍然没有FDA批准的HCC液体活检检测，主要是因为这些检测缺乏生存获益的报告。应用多种体液液体活检标志物，从单个血液样本中解锁更多的诊断信息，或者应用多种体液液体活检标志物，能否进一步提高HCC早期诊断的准确性仍需要继续探索。

Figure 1. Biomarker source and detection principle of liquid biopsy in blood

图1. 血液中液体活检生物标志物来源及检测原理

3. 细胞外囊泡(Extracellular Vesicle, EV)

EV是由细胞释放到细胞外环境中的囊泡状小体，它可选择性地富集特定蛋白和核酸，以介导细胞间通讯并激活靶细胞中的信号通路。EV可根据其直径大小分为：外泌体(直径40~150 nm)、微泡(直径100~1000 nm)和凋亡小体(直径1000~5000 nm)。通过对肝细胞癌患者血清EV的研究发现，其在肝细胞癌的发病过程中发挥着重要的作用。一方面，肿瘤细胞来源的EV参与肿瘤的发生、发展与转移；另一方面，正常细胞分泌的EV可将抑癌基因表达产物传递至癌变的细胞内，通过阻断相应的信号通路，抑制癌细胞增殖。EV中可检测到mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA和DNA等多种核酸，这表明与传统的肿瘤生物标志物测定相比，EV中的内容物可提供更多特定生物标志物的信息[15]。通过监测EV内特定生物标志物将是一种方便且精准的非侵入性肿瘤早期检测和诊断方法[16] [17]。

EV中的mRNA、microRNA、circRNA、smRCs表现出作为HCC生物标志物的潜力[18]-[20]。Won Soh等[21]发现与慢性乙型病毒性肝炎或肝硬化患者相比，HCC患者的血清外泌体miR-18a、miR-221、miR-222和miR-224的水平显著升高，而血清外泌体miR-101、miR-106b、miR-122和miR-195的水平显著降低。另一项研究从HCC组织和相邻肝组织中分离出EV进行miRNA水平测序。发现hsa-miR-483-5p在HCC EV中高表达，并通过结合CDK15，下调CDK15表达，最终促进HCC进展[22]。这表明EV中miR-483-5p可作为HCC诊断的潜在生物标志物。

基于EV的癌症诊断的多项研究表明，EV转录组和蛋白质组生物标志物可以提高癌症早期检测的敏感性。有研究分析了血浆外泌体中的差异表达蛋白，在慢性乙型肝炎组和肝癌组之间筛选出了25种差异表达的蛋白质。通过ROC曲线和AUC值的计算，发现CO9、LBP、SVEP1和VWF在血浆外泌体中的表达水平可以作为诊断慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌的新型生物标志物，具有较高的诊断准确性和敏感性[23]。有学者开发了一种基于HCC EV表面蛋白的检测方法，称为 HCC EV ECG评分，用于早期诊断HCC [24]。该方法利用四种与HCC相关的蛋白标记物来纯化和定量HCC EV的八个亚群，从这八个亚群中筛选出三个与HCC最相关的亚群并构建了一个逻辑回归模型，即HCC EV ECG评分，用于区分早期HCC和肝硬化。并在验证队列中证明其具有高敏感性和特异性，且该模型在检测早期HCC方面明显优于AFP。另外，有研究利用尿液外泌体的糖蛋白组学分析来筛选HCC的潜在生物标志物，发现了一些与HCC相关的异常糖基化蛋白，如LG3BP，PIGR，KNG1和ASPP2，它们在尿液外泌体中的特定位点的糖基化形式可能是HCC的潜在非侵入性候选生物标志物[25]。

尽管利用EV进行液体活检显示出了强大的早期诊断HCC潜能，但仍然存在一些限制。现缺乏获取肿瘤特异性EV的方法，从EV中分离的载体分子可能来自其他组织源，包括非恶性组织，这些组织会自发释放EV到全身循环中。且目前从体液中分离EV尚无一个确切、高效的标准流程。新兴的纳米技术的出现可能有助于解决EV液体活检现阶段所面临的困境。

4. 循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells, CTCs)

循环肿瘤细胞是从原发性和转移性肿瘤释放的细胞，其脱落到血液或淋巴管中并参与外周血循环。通过检测循环肿瘤细胞辅助诊断HCC同样是研究热点。有研究检测了患者血液中的CTCs和肿瘤干细胞(CSCs)中CK19、CD133、CD90、MAGE1和MAGE3等特异性标记物，这些标志物的表达水平与肿瘤的分级和分期有显著相关性，提示它们具有早期诊断和预测预后的价值。另外，该项研究还发现CK19和CD90可以用于HCV相关HCC的早期筛查[26]。Cheng [27]等研究发现，在HCC患者的外周血中所有表型的CTCs均明显高于非恶性肝病患者，且总CTCs具有最高的诊断价值(AUC 0.774)，高于传统的AFP标志物(AUC 0.669)。有研究者提出了一个基于循环肿瘤细胞生物标志物和常规生化指标组合的新的评分系统HCC-CTCs，发现其具有高度的敏感性和特异性，能够区分早期HCC患者和慢性肝炎患者，且优于AFP的诊断能力[28]。

然而，在血液中CTC的表达极低，现有的富集策略不能满足临床要求，且现未发现在HCC患者CTC中稳定表达的位点特异性标志物，CTC检测用于HCC患者的诊断仍需进一步研究。

5. 肿瘤诱导血小板(Tumor-Educated Platelets, TEPs)

血小板是从成熟巨核细胞中脱落的无细胞核碎片，主要参与人体生理性止血过程。大量研究表明，血小板与肿瘤细胞可通过直接或间接方式相互作用，参与肿瘤的增殖与转移、免疫逃逸和获得耐药性。循环血小板在其生命周期中可主动摄取和富集肿瘤衍生的蛋白质和mRNA [29]。此外，肿瘤细胞分泌的刺激因子，如二磷酸腺苷、IgG或RNA，可通过改变来自巨核细胞的pre-mRNA剪接和蛋白质合成过程，诱导血小板内蛋白质组学和转录组学谱发生显著变化[30] [31]。因此，针对TEPs的液体活检可作为一种潜在的肿瘤早期诊断手段。

既往研究已经表明TEPs在肝细胞癌早期诊断中的应用潜力。Asghar [32]开展了一项小样本量研究，发现血小板中TGF-β、NF-κB、VEGF、AKT和PI3K作为生物标志物，均可成功地将HCC患者与对照组区分开，其中AKT和PI3K在检测早期HCC方面具有更好的潜力。Waqa [33]发现，肝硬化结节背景患者TEP中包含的CTNNB1、Rho A、SPINK1、IFITM3和SERPIND1等mRNA，在诊断早期HCC表现出强大的诊断能力，其联合AUC值可达1.0。有研究团队在HCC患者和对照患者的血液样本中筛选出250个差异表达miRNA，其中miR-495-3p和miR-1293诊断HCC的AUC值分别可达0.76和0.78 [34]。Zhao等[35]的研究表明，SNORD12B、SNORA63和SNORD14E三种TEP snoRNAs联合诊断早期HCC的诊断性能强，其AUC值为0.92。虽然相关研究已经证实TEPs在肿瘤诊断中的潜力，但目前对TEPs的机制的理解仍不完善，需要进行后续的深入研究。

6. 各生物标志物优缺点

目前，肝细胞癌早期诊断研究主要集中于cfNAs、CTCs和外泌体，因其来源、物理性质和携带信息的不同，在稳定性、灵敏度和信息维度上存在显著差异。ctDNA中突变片段的含量通常极低，且与大量来源于正常细胞的cf-DNA混合，识别突变片段依赖于灵敏度更高的测序技术。DNA甲基化异常常发生于肿瘤早期，且在ctDNA中丰度相对较高，稳定性更好，结合高通量靶向测序技术能够更稳定的识别早期肿瘤。cfDNA主要来源于坏死和凋亡细胞，而细胞外囊泡主要由活细胞分泌，表明EV可能更好和更早的反映肿瘤状态。在一项研究中，作者同时使用EV DNA和cfDNA检测EGFR突变，发现EV DNA表现出更高的敏感性[36]。另一项研究发现，EV DNA用于诊断早期非小细胞肺癌的灵敏度和特异度均优于cfDNA [37]。肿瘤细胞释放入血可发生在肿瘤发展的各个阶段，因此CTCs可以作为肝细胞癌的诊断、疗效评价及预后分层的液体活检生物标志物。血液中循环肿瘤细胞数量稀少，特别是在肿瘤早期，因此CTC用于癌症早期诊断能力相对不足，现其应用主要集中于晚期患者的预后评估和转移生物学基础研究。

7. 总结与展望

液体活检技术应用于肝细胞癌早期诊断具有很大的潜力，但仍存在许多问题亟待解决。液体活检在实际应用中的一个关键限制是需要分离、纯化和检测生物标记物。因此，必须发展新的检测技术和分析平台，建立标准化的操作程序和数据分析流程，以提高液体活检的准确性。此外，机器学习等大数据技术的引入将有助于开发将生物标志物与临床指标相结合的最优化诊断模型。随着新型检测技术的进步和新型生物标志物的开发，可预见液体活检技术将在肝细胞癌的早期诊疗中发挥重要作用。

NOTES

^*通讯作者。