1. 引言
金黄色葡萄球菌是临床常见革兰氏阳性致病菌，在感染病例中频繁检出。随抗生素广泛应用及滥用，其耐药性日趋严峻，其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的流行给全球公共卫生带来巨大挑战[1]。数据显示，MRSA在金葡菌分离株中检出率达34.15%，对β-内酰胺类抗生素普遍耐药，对万古霉素敏感性亦下降，导致治疗难、病死率高，治疗方案受限[2]。MRSA还易形成生物膜，阻碍抗生素渗透并逃逸免疫清除，加剧感染难治性。其生物膜形成机制复杂，含ica操纵子调控PIA合成及非PIA依赖通路[3]。因此，探索阻断生物膜形成且不易诱导耐药的新策略，是当前抗MRSA研究的重要课题。
血小板裂解物来源于血小板，富含多种生长因子与具有抗菌活性的蛋白质成分，近年来在组织工程与再生领域表现出良好的应用前景。已有研究报道其对MRSA生长具有一定抑制效果，并与庆大霉素存在协同作用[4]。血小板是天然免疫的重要组成部分，参与机体的各项免疫应答。最新研究表明，源自富血小板血浆(PRP)的活性成分在体内外实验中均显示出对金黄色葡萄球菌生物膜的清除作用[5]。然而，关于血小板裂解物能否干预MRSA生物膜的形成，特别是其作用是否与PIA依赖性途径相关，目前尚未有系统性的研究报道。
综上，本研究合理提出假设：血小板裂解物可能通过影响MRSA的初始黏附阶段抑制生物膜的形成。为此，本研究系统评价血小板裂解物对生物膜形成的抑制作用，初步分析其作用机制是否与PIA通路相关，旨在为今后开发基于血小板活性成分的抗生物膜治疗方法提供理论与实验依据。
2. 材料与方法
2.1. 材料、试剂与仪器
实验菌种均由新疆医科大学第六附属医院检验科提供，且耐药性经临床抗菌耐药性的验证。
MHB肉汤、TSB肉汤、BHI肉汤。结晶紫、刚果红。恒温培养摇床、多功能酶标仪、超净工作台、全自动血细胞计数仪、低速冷冻离心机。
2.2. 实验方法
2.2.1. 富含血小板血浆及血小板裂解物的制备
使用含ACD-A抗凝剂的采血管采集6位适龄健康志愿者的静脉血，经两次差速离心获得浓缩PRP。使用血细胞计数仪计数，将血小板浓度统一校准为1500 × 103/μL，并以此定义为本实验中的“1X”浓度，与PBS溶液按不同比例混合得不同浓度的PRP。将PRP分装后，于−80℃和37℃下反复冻融6次以充分裂解血小板。裂解液经高速离心、过滤除菌后即得PL。
2.2.2. 最小抑菌浓度测定
采用临床实验室标准化协会(CLSI)推荐的肉汤微量稀释法[6]，在96孔板中用MHB对PL进行2倍系列稀释(起始浓度为“4X”)，将MRSA菌液浓度调整至0.5麦氏浊度后加入96孔板，使其终浓度约为5 × 105 CFU/mL。置于37℃条件下培养18至24小时后，以肉眼观察未见明显细菌生长时所对应的最低药物浓度判定为最低抑菌浓度(MIC)。实验独立重复3次。
2.2.3. 结晶紫染色测定生物膜含量
生物膜形成抑制实验：在96孔板中，将MRSA菌液(OD600 = 0.1，TSB + 1%葡萄糖配制)与实验浓度的PL同时加入，37℃静置培养24小时。
成熟生物膜干预实验：先接种MRSA菌液培养24小时形成成熟生物膜，弃上清并轻柔洗涤后加入含不同实验浓度的PL继续培养24小时。
培养结束后，孔板经PBS洗涤、甲醇固定、0.1%结晶紫染色，用33%冰醋酸溶解染料后，测量酶标仪590 nm时的吸光度值。实验独立重复3次。
2.2.4. 刚果红平板法测定PIA
将过夜培养的MRSA菌液与等体积得1X、2X浓度的PL混合，室温孵育30分钟。对照组用PBS处理。取2 μL混合液点种子含0.08%刚果红和1%葡萄糖的BHI琼脂平板上，37℃培养72小时后，观察并记录菌落颜色与形态。
2.2.5. 扫描电子显微镜观察
在无菌24孔板中放入经多聚赖氨酸预处理的玻片，加入MRSA菌液(制备方法同2.2.3)培养24小时以充分形成生物膜。实验分为PBS处理对照组、“1X”浓度PL处理组和“2X”浓度PL处理组。处理24小时后，取出玻片，用0.1 MPBS (pH 7.4)轻柔漂洗3次以去除浮游菌。在4℃使用2.5%戊二醛溶液固定，乙醇梯度脱水15分钟。经临界点干燥、喷金处理后，使用扫描电子显微镜在加速电压5.0 kV下观察并拍摄生物膜表面形貌。
2.3. 统计分析
所有实验数据以均值 ± 标准差表示。采用GraphPadPrism9.0软件进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较使用Tukey’s多重比较检验。以P < 0.05为差异具有统计学意义。
3. 结果
3.1. PL对MRSA浮游菌的抗菌活性
采用肉汤微量稀释法测定血小板裂解物(PL)对MRSA浮游菌的最小抑菌浓度(MIC)。在实验设定的浓度范围(“1X”至“4X”)内，与细菌生长对照组相比，各浓度PL处理组在培养终点均未观察到肉眼可见的浊度差异，因此未检测到明确的MIC值。
3.2. PL对MRSA生物膜形成的影响
采用结晶紫染色法定量评估不同浓度血小板裂解物对MRSA生物膜形成的影响，结果如图1所示。经24小时共培养后，各处理组的生物膜生物量与对照组相比均有不同程度下降，且具有统计学意义(P < 0.05)。1XPL组的生物膜形成抑制率为13.09%，2XPL组的抑制率为19.74%。
Figure 1. Effect of PL on MRSA biofilm
图1. PL对MRSA生物膜的影响
3.3. PL对成熟MRSA生物膜的影响
为探究PL对成熟生物膜的作用，我们对成熟(48小时)生物膜进行PL干预。结晶紫染色结果显示(图2)，不同浓度的PL处理组24小时后的OD590值与PBS对照组相比无统计学差异(P > 0.05)。
3.4. PL对PIA生成的影响
Figure 2. Results of Congo red agar assay
图2. 刚果红实验结果
PBS对照组MRSA菌落呈现黑色、干燥、表面粗糙的形态。经1X PL与2X PL预处理的实验组，其菌落同样呈现黑色、干燥且表面粗糙的表型。在菌落颜色深度、干燥程度及表面形态方面，各PL处理组与对照组之间未见明显差异。
3.5. PL对MRSA生物膜微观结构的影响
如图3所示，与PBS处理的对照组相比，经血小板裂解物处理24小时的MRSA生物膜，其微观结构发生明显改变。对照组生物膜结构致密，细菌被大量胞外基质包裹并紧密粘连，形成连续的三维网状结构。PL处理组生物膜结构则变得稀疏且不连续。视野中细菌多以游离状态或小团簇形式存在，细菌间的胞外基质连接显著减少，完整的网状结构被破坏。
Figure 3. Comparative SEM images
图3. 扫描电镜对比图
4. 讨论
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌所致的临床感染目前仍是临床治疗中的棘手问题。该菌株耐药性强，感染后易复发，给临床带来了诸多挑战。生物膜是细菌形成的结构性保护屏障，可帮助其躲避宿主免疫清除、抵抗抗菌药物作用，其形成由多种调控机制共同参与，并非单一途径介导。近年来针对生物膜形成早期的干预手段，尤其是“抗毒力”策略，因不直接产生杀菌效应同时能降低耐药诱导风险，已成为抗感染领域的研究重点。本研究来源于血小板的血小板裂解物为研究对象系统评估了亚抑菌浓度下对MRSA生物膜的干预效果。已有研究证实[7]，血小板及其裂解物对MRSA等多种病原体具有显著体外抗菌活性为本次实验奠定了重要理论基础。实验发现PL无直接杀灭MRSA的作用，但能有效抑制其生物膜早期形成、破坏已形成的膜结构，且该作用不依赖经典PIA合成通路，提示其可能通过靶向生物膜形成初始环节发挥抗生物膜功效，为开发基于血液成分的新型抗感染方案提供了新的实验依据与理论参考。
本研究通过结晶紫染色实验证实，PL以浓度依赖的方式显著抑制MRSA生物膜。但PL对已成熟的生物膜影响甚微，这一结果暗示其作用靶点可能位于生物膜建立的初始阶段，即细菌的表面黏附与早期微菌落形成期。此推测在扫描电镜观察中得到印证：PL处理使原本致密、连续的生物膜结构变得稀疏、破碎，细菌多以分散或小团簇形式存在，胞外基质网络显著减少。这种形态学改变与典型的生物膜抑制剂作用特征相符，进一步支持PL主要干扰了生物膜的黏附组装过程，而非降解已形成的成熟生物膜。也有研究发现富血小板血浆可有效抑制铜绿假单胞菌和大肠杆菌的生物膜形成[8]，这展现了血小板相关制剂对生物膜的抑制作用的极大前景。
为探究相关机制，本研究评估了PL对PIA合成的影响。刚果红实验显示，PL处理组并未影响PIA的生成，表明其抗生物膜效应不依赖于由ica操纵子介导的PIA依赖性通路。这与其他天然化合物如大黄素(通过下调ica操纵子)或巴西苏木素(通过抑制转录调控因子SarA以影响ica表达)的作用机制形成鲜明对比。本研究的发现将PL抑制MRSA生物膜的机制探究方向引向了PIA非依赖性的黏附途径。研究证实由血小板来源的特定抗菌蛋白血小板杀菌蛋白(tPMP-1)的作用机制为靶向细菌细胞质膜[9]，因此，血小板及其衍生物的抑菌活性的发挥较为复杂，这也为PL可能通过非PIA依赖途径发挥作用提供了视角。除直接竞争黏附位点外，PL亦可能通过影响其他调控通路间接干扰生物膜形成。MRSA生物膜的建立还受到群体感应系统(如Agr系统)、全局调控因子(如SarA)以及细菌代谢状态的精密调控。并且有研究发现血小板裂解物中的关键成分血小板因子4不仅能直接结合细菌、促进清除，还显示出抗生物膜活性[10] [11]。PL中富含的血小板源性因子是否可能模拟宿主信号，干扰上述细菌细胞间的通讯或基因表达程序也是一个值得探究的方向。然而，本研究观察到的PL对成熟生物膜无效的现象，一定程度上降低了其通过影响群体感应(常在生物膜发育后期发挥作用)或强力降解基质的可能性。因此，干扰初始黏附仍是最能统一解释本研究全部发现的核心机制。
综上，本研究首次揭示了血小板裂解物在非杀菌浓度下以一种不依赖经典PIA通路的方式有效干预MRSA生物膜的形成。PL中具体的效应分子有待进一步纯化与鉴定，未来的研究可从分离PL中关键的活性因子出发，并将其作用机制与已知的黏附素通路进行相关性检验。此外，将血小板膜作为功能性载体或中和剂以靶向清除细菌及其毒素的新兴研究[12]，也为基于PL成分的抗生物膜策略设计提供了新视角。这一工作方向有望将本研究发现的表型现象转化为一种具有明确靶点和机制的抗生物膜新策略。
基金项目
基金名称：血小板裂解物靶向SarA抑制ica依赖性PIA干预MRSA生物膜形成的研究；基金等级：自治区级。自治区研究生科研创新项目(编号：XJ2025G155)。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。