1. 引言
黄精来源于百合科(Liliaceae)黄精属(Polygonatum)多年生草本植物,是我国传统的药食两用药材,其药用记载最早见于晋代《名医别录》[1]。根据2020年版《中华人民共和国药典》规定,包括滇黄精(Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl.)、黄精(P. sibiricum Red.)和多花黄精(P. cyrtonema Hua),均以干燥根茎入药[2]。中药黄精富含多糖、生物碱、黄酮、三萜、甾体皂苷、木脂素及挥发油等活性物质,具有降血糖、提高免疫力、抗肿瘤、抗炎、抗衰老和抗氧化等药理活性[3]-[5],用于治疗心脑血管疾病、感染性疾病、糖尿病、高血脂、骨质疏松、阿尔茨海默病、肝病、肾病等[6]-[8]。其中,多糖含量最高,降血糖活性显著[9];皂苷含量高达6.49%,具有抗疲劳、抗氧化、降血糖、降血脂、增强免疫力、抗炎、抗病毒等药理活性[10];黄酮类化合物种类亦很丰富,具有降血糖、抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗菌等活性[11]。
目前黄精多糖的提取方法主要包括热回流提取法、水提醇沉法、热水提取法和超声提取法等[12]-[15]。方法虽多,但提取率均不高,且不同提取方法对其组成、糖苷键构型、分子量等产生显著的影响,从而导致药理活性研究结果缺乏统一性[16]-[18]。本研究采用热回流提取法获得水提物后再经水提醇沉得到黄精中的总多糖,以蒽酮–硫酸比色法测定的多糖提取率为指标,从粉碎粒度、提取时间、提取次数和pH值考察影响多糖提取率的单因素,采用响应面法进一步获得提取条件的优化实验。在此基础上,测试最佳提取工艺下获得的黄精多糖体外抗氧化和降血糖活性。
2. 材料
2.1. 药材、试剂及试剂盒
黄精购自贵州省遵义市药材市场,经遵义医药高等专科学校叶菊教授鉴定。蒽酮,国药集团化学试剂有限公司;浓硫酸,重庆川东化工集团有限公司;石油醚、正丁醇、三氯甲烷、氢氧化钠,成都金山化学试剂有限公司;无水葡萄糖,上海麦克林生化科技股份有限公司;所用其他化学试剂均为分析纯。ABTS+自由基、DPPH自由基、OH−自由基和
自由基清除能力检测试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司;α-淀粉酶活性检测试剂盒购自北京盒子生工科技有限公司;α-葡萄糖甘酶活性检测试剂盒购自上海科艾博生物有限公司。
2.2. 仪器
电子天平(PTX-FA210),华志电子科技有限公司;中药粉碎机(DFY-600C),上海左乐仪器有限公司;旋转蒸发仪(IKARV3),郑州长城科工贸有限公司;恒温水浴锅(HH-ZK8),巩义市科瑞仪器有限公司;循环水式真空泵(SHZ-Dш),常州金坛精达仪器制造有限公司;电热恒温干燥箱(101-2A),天津市泰斯特仪器有限公司;台式低速离心机(TD6),长沙英泰仪器有限公司;omega多功能酶标仪,德国BMG LABTECH公司。
3. 方法
3.1. 供试品溶液制备
称取3.03 g黄精粉末,加入75.0 mL蒸馏水,置于80℃热水浴回流,提取时间2 h,过滤,收集上清液,沉淀再次重复上述步骤提取1次,将两次得到的上清液合并,减压浓缩至10.0 mL。向浓缩液中加入50.0 mL的95%乙醇,充分混匀后,4℃静置过夜,离心,收集所得的多糖沉淀,用适量蒸馏水完全溶解,再加入Sevage试剂(氯仿与正丁醇的体积比为4:1),充分振荡混合,以除去溶液中的蛋白质,对上层多糖溶液进行减压浓缩处理,干燥后即得。
3.2. 多糖提取率测定
3.2.1. 对照品溶液制备及线性关系考察
称取无水葡萄糖10.01 mg,蒸馏水定容至100 mL的容量瓶,即得。分别移取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的葡萄糖对照品溶液,转移至10 mL具塞试管中,分别加入蒸馏水定容至2.0 mL,另取2.0 mL蒸馏水作为空白对照,在625 nm波长处测定各试管内溶液的吸光度。以葡萄糖溶液浓度为横坐标,吸光度(A)为纵坐标进行回归,得方程为A = 20.071x + 0.1004 (R2 = 0.9994),在0~0.05 mg/mL范围内线性关系良好。
3.2.2. 测定方法
适当稀释黄精多糖样品,代入绘制好的标准曲线,计算出样品中的多糖浓度,从而计算出黄精多糖提取率。
多糖得率(%) = C × V × N/M × 103 × 100%
式中:C为提取液中多糖的浓度;V为多糖提取液的总体积;N为稀释倍数;M为样品粉末质量。
3.3. 方法学考察
3.3.1. 精密度试验
取对照品溶液适量,按“3.2.2”项下方法测定吸光度6次,计算日内精密度,测得RSD值为1.56%,表明仪器精密度满足试验要求。
3.3.2. 稳定性试验
取供试品溶液,每隔4 h按“3.2.2”项下方法测定吸光度进行测定,即0、4、8、12、16、20、24 h,测得RSD值为1.10%,表明溶液在24 h内稳定性良好。
3.3.3. 重复性试验
取同一批药材6份,按“3.1”项下方法制备供试品溶液,按“3.2.2”项下方法测定吸光度,测得RSD值为1.66%,表明该方法重复性良好。
3.3.4. 加样回收率试验
取多糖含量已知的供试品溶液6份,加入对照品溶液,按“3.2.2”项下方法测定吸光度,计算回收率。得到平均加样回收率为99.86%,RSD值为2.49%。
3.4. 单因素试验
在“3.1”项下供试品提取方法的基础上,选择粉碎粒度(50目、65目、80目、100目、120目、150目)、提取时间(1 h, 1.5 h, 2 h, 2.5 h, 3 h)、提取次数(2次、3次、4次)、pH值(6, 7, 8, 9, 10)作为影响因素,按“3.2.2”项下方法考察其对多糖提取率的影响,平行3次。
3.5. 响应面法优化总多糖的提取
依据Box-Behnken中心设计原理,对黄精多糖的提取工艺进行优化[19]。在单因素试验的基础上,选取对黄精多糖提取效果影响较大的因素粉碎粒度、提取时间、pH值为自变量,以黄精多糖提取率为响应值。利用Design-Expert.12软件进行响应面实验设计以及进行数据分析,所有响应面试验均进行三次独立重复,表中数据为平均值 ± 标准差[20] [21]。响应面的水平设计见表1。
Table 1. Response surface experimental factor design and level
表1. 响应面实验因素设计与水平
水平 |
因素 |
X1 (粉碎粒度) |
X2 (提取时间) |
X3 (pH值) |
−1 |
100 |
1.5 |
7 |
0 |
120 |
2.0 |
8 |
1 |
150 |
2.5 |
9 |
3.6. 体外抗氧化活性测定
将多糖配制0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的溶液作为测定组,将Trolox配成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL溶液作为阳性对照组,以甲醇为空白组。首先,在96孔板先加入190 μL工作液,其次在空白组加入10 μL甲醇,在阳性对照组加入10 μL Trolox、在测定组加入不同浓度多糖,最后涡旋混匀,室温避光静置30 min。酶标仪预热30 min以上,调节波长至515 nm,测其吸光度,分别记为A空白、A对照、A测定,计算公式如下。
DPPH自由基清除率 = [A空白 − (A测定 − A对照)] ÷ A空白 × 100%
3.6.1. ABTS+自由基清除能力测定
在“3.6.1”项下的基础上,首先在96孔板先加入170 μL工作液、20 μL反应液,其次在空白组加入10 μL甲醇、在阳性对照组加入10 μL Trolox、在测定组加入不同浓度多糖,最后充分混匀,室温避光静置6 min。酶标仪预热30 min以上,调节波长至405 nm,测其吸光度,分别记为A空白、A对照、A测定,计算公式如下。
ABTS+自由基清除率 = [A空白 − (A测定 − A对照)] ÷ A空白 × 100%
3.6.2. OH−自由基清除能力测定
在“3.6.1”项下的基础上,于1.5 mL EP管中,加入提取液与反应液,充分混匀。在空白组加入100 μL甲醇、在阳性对照组加入50 μL Trolox、在测定组加入不同浓度多糖,涡旋混匀,置于37℃水浴锅准确反应60 min。10000 rpm,常温离心10 min,取200 μL上清于96孔板中。酶标仪预热30 min以上,调节波长至536 nm,测其吸光度,分别记为A空白、A对照、A测定,计算公式如下。
OH−自由基清除率 = (A测定 − A对照) ÷ (A空白 − A对照) × 100%
3.6.3.
自由基清除能力测定
在“3.6.1”项下的基础上,于1.5 mL EP管中,首先在空白组加入100 μL甲醇、在阳性对照组加入100 μL Trolox、在测定组加入不同浓度多糖,其次分别加入提取液,混匀,37℃水浴20 min。再加入反应液,混匀,37℃水浴20 min。最后加入100 μL氯仿。混匀,8000 rpm,常温离心5 min,取200 μL水相于96孔板中。酶标仪预热30 min以上,调节波长至530 nm,测其吸光度,分别记为A空白、A对照、A测定,计算公式如下,其中,W是提取超氧阴离子的样品的重量。
含量 = 0.0625 × (A测定 − A空白) ÷ (A对照 − A空白) ÷ W
3.7. 体外降血糖活性测定
3.7.1. α-葡萄糖甘酶抑制活性
在“3.6.1”项下的基础上,将阿卡波糖配成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL溶液作为阳性对照组。于1.5 mL EP管中,首先加入提取液与反应液,在测定组加入不同浓度多糖,充分混匀,37℃水浴30 min,立即放入沸水浴中煮沸5 min。在阳性对照组加入100 μL阿卡波糖,混匀,8000 rpm,常温离心5 min,取70 μL上清液和130 μL工作液于96孔板中。酶标仪预热30 min以上,调节波长至400 nm,测其吸光度,分别记为A空白、A对照、A测定,计算公式如下。
α-葡萄糖甘酶抑制率% = [A空白 − (A测定 − A对照)] ÷ A空白 × 100%
3.7.2. α-淀粉酶抑制活性
在“3.6.1”项下的基础上,于1.5 mL EP管中,首先,在测定组加入0.5 mL不同浓度多糖和900 μL蒸馏水充分混匀,置于冰上待测。其次在阳性对照组加入100 μL阿卡波糖,在空白组加入100 μL甲醇。混匀,70℃水浴15 min。最后加入反应液与工作液,沸水浴处理10 min。吸取200 μL于96孔板中。酶标仪预热30 min以上,调节波长至540 nm,测其吸光度,分别记为A空白、A对照、A测定,计算公式如下。
α-淀粉酶抑制率% = [A空白 − (A测定 − A对照)] ÷ A空白 × 100%
3.8. 数据分析
采用Excel 2021软件整理原始数据,IBM SPSS Statistics 27软件进行方差分析,Origin 2024软件绘制折线图,Design-Expert.12件进行响应面分析。
4. 结果与分析
4.1. 单因素试验
4.1.1. 粉碎粒度参数筛选
由图1可知,粉碎粒度对提取率影响显著,在粒度为120目时多糖提取率达到峰值为8.12%。当粉碎粒度为150目时,易导致粉末结块和杂质溶出剧增,阻碍了溶剂的有效渗透与多糖的充分溶出,致使提取率下降,故选择100目、120目、150目。
Figure 1. Effect of crushing size on extraction rate of P. sibiricum polysaccharide
图1. 粉碎粒度对黄精多糖提取率的影响
4.1.2. 提取时间参数筛选
由图2可知,提取时间达到2 h时,黄精多糖提取率达到最大值8.6%。随着提取时间的延长,热渗透与溶剂扩散作用持续增强,有利于细胞内多糖成分的充分溶出,1~2 h时间内多糖提取率显著增高。2 h后多糖提取率呈下降趋势分析原因与高温加热易导致多糖类成分发生降解、水解或结构变性影响后续醇沉效果有关,故选择1.5 h、2 h、2.5 h。
Figure 2. Effect of extraction time on extraction rate of P. sibiricum polysaccharide
图2. 提取时间对黄精多糖提取率的影响
4.1.3. 提取次数参数筛选
由图3可知,多糖提取率随提取次数增加呈先增后缓的趋势,提取3次多糖得率最佳,表明提取3次原料中可溶性多糖可得到充分的提取,故确定提取次数为3次。
Figure 3. Effect of extraction times on extraction yield of P. sibiricum polysaccharide
图3. 提取次数对黄精多糖提取率的影响
4.1.4. 提取pH值参数筛选
由图4可知,植物受到碱性环境的影响使其细胞壁发生软化有利于多糖的溶出,结果显示当pH值为8时达到峰值8.62%。pH值为9时,提取环境为较强的碱性环境,多糖类成分会发生降解反应,结果显示多糖得率显著降低,故选择pH值为7、8、9。
Figure 4. Effect of pH on extraction rate of P. sibiricum polysaccharide
图4. pH对黄精多糖提取率的影响
4.2. 响应面优化多糖提取实验
以粉碎粒度、提取时间、提取pH作为实验因素,设定响应值为黄精总多糖提取率,实验设计和结果见表2。对表2中数据进行回归拟合得到方程:Y = −39.75192 + 0.217849X1 + 6.08298X2 + 8.07975X3 + 0.048196X1X2 + 0.004549X1X3 + 1.19000X2X3 − 0.001543X12 − 5.48800X22 − 0.707000X32 (R2 = 0.9638, R2a = 0.9172)。回归分析及方差分析结果见表3。
Table 2. Experimental design and determination results of response surface for extraction of P. sibiricum polysaccharide (
, n = 3)
表2. 黄精多糖提取响应面试验设计及测定结果(
, n = 3)
试验号 |
因素 |
X1 |
X2 |
X3 |
黄精多糖含量(%) |
1 |
1 |
0 |
1 |
5.63 |
2 |
−1 |
0 |
−1 |
8.51 |
3 |
0 |
0 |
0 |
9.16 |
4 |
0 |
1 |
1 |
6.89 |
5 |
0 |
0 |
0 |
9.07 |
6 |
0 |
0 |
0 |
8.28 |
7 |
1 |
1 |
0 |
5.91 |
8 |
1 |
0 |
−1 |
6.14 |
9 |
−1 |
1 |
0 |
6.08 |
10 |
0 |
−1 |
−1 |
7.63 |
11 |
1 |
−1 |
0 |
5.21 |
12 |
0 |
−1 |
1 |
6.04 |
13 |
0 |
0 |
0 |
8.77 |
14 |
−1 |
0 |
1 |
7.46 |
15 |
−1 |
−1 |
0 |
7.88 |
16 |
0 |
1 |
−1 |
6.10 |
17 |
0 |
0 |
0 |
8.44 |
Table 3. Analysis of variance of regression model
表3. 回归模型的各项方差分析
方差来源 |
平方和 |
自由度 |
均方 |
F值 |
P值 |
显著性 |
模型 |
27.00 |
9 |
3.00 |
20.69 |
0.0003 |
** |
X1 |
6.20 |
1 |
6.20 |
42.73 |
0.0003 |
** |
X2 |
0.2066 |
1 |
0.2066 |
1.42 |
0.2715 |
- |
X3 |
0.6312 |
1 |
0.6312 |
4.35 |
0.0754 |
- |
X1X2 |
1.48 |
1 |
1.48 |
10.21 |
0.0152 |
* |
X1X3 |
0.0528 |
1 |
0.0528 |
0.3639 |
0.5654 |
- |
X2X3 |
1.42 |
1 |
1.42 |
9.77 |
0.0167 |
* |
X12 |
3.54 |
1 |
3.54 |
24.39 |
0.0017 |
** |
X22 |
7.93 |
1 |
7.93 |
54.66 |
0.0002 |
** |
X32 |
2.10 |
1 |
2.10 |
14.52 |
0.0066 |
- |
残差 |
1.01 |
7 |
0.1450 |
- |
- |
- |
失拟向 |
0.4273 |
3 |
0.1424 |
0.9693 |
0.4897 |
>0.05 |
误差 |
0.5877 |
4 |
0.1469 |
- |
- |
- |
总差 |
28.02 |
16 |
- |
- |
- |
- |
注:*表示差异显著(P < 0.05),**表示差异极显著(P < 0.01),统计分析方法:方差分析。
方差分析结果显示,回归方程的P < 0.01,表明该模型在本次试验研究范围内具有统计学意义。失拟项P > 0.05,表明失拟向不显著,说明回归方程拟合程度良好,可反映出黄精多糖的含量与粉碎粒度、提取时间及pH值之间的关系;多元相关系数R2为0.9638,
为0.9172,这充分说明所构建模型的实际值与预测值之间存在较强的相关性,模型对数据的拟合效果良好。从F值可以看出,在所选因素水平范围内,各个因素对黄精多糖提取率影响程度的顺序是:粉碎粒度 > 提取pH值 > 提取时间。
最佳提取工艺条件的确定及验证试验
通过对模型的拟合分析,得出最佳的提取工艺为:粉碎粒度120目、提取时间2 h/次、提取次数2次、pH 8、水浴温度80℃。在此条件下对黄精多糖进行提取方法的验证,并进行了3次重复提取,结果得到多糖的提取率分别是13.50%、13.08%和13.40%,RSD值为2.97%,低于3%,结果表明此提取工艺不存在显著性差异,重复性良好,具有可行性。
为了清晰且直观地展现出两两因素之间交互作用对响应值变化强度的影响,借助所构建的回归方程,绘制响应面图及其对应的等高线图。结果见图5~7。
Figure 5. Response surface and contours of the effect of crushing particle size and extraction time on the extraction rate of P. sibiricum polysaccharide
图5. 粉碎粒度与提取时间对黄精多糖提取率影响的响应面和等高线
响应面的坡度以及等高线的密集程度,是能够直观体现各因素间交互作用对响应值影响程度的重要指标[22]。响应面的坡度越陡峭,意味着在该区域内,因素之间的交互作用对响应值的改变效果越显著,即交互作用对响应值的影响越大。而对于等高线而言,当它们较为密集且呈现出椭圆形时,说明在这一因素水平组合的范围内,各因素之间的交互作用对响应值的作用明显;反之亦然[23]。由图5可知,粉碎粒度(X1)与提取时间(X2)交互作用的等高线图似椭圆形,且响应面图坡度较陡,表明这两因素间交互作用对多糖提取率的影响显著;由图6可知,粉碎粒度(X1)与提取pH值(X3)交互作用的响应面图坡度较缓,等高线较疏,倾向于圆形,表明粉碎粒度和pH值之间交互作用影响不显著;由图7可知,提取时间(X2)与提取pH值(X3)之间相互作用的响应面图坡度陡峭,等高线图椭圆形分布较密集,说明提取时间与提取pH值两两交互作用对黄精多糖提取率影响显著。综合分析,两两交互作用影响程度依次是:X1X2 (粉碎粒度与提取时间) > X2X3 (提取时间与提取pH值) > X1X3 (粉碎粒度与提取pH值)。
Figure 6. Response surface and contours of the effect of crushing particle size and extraction pH on the extraction rate of P. sibiricum polysaccharide
图6. 粉碎粒度与提取pH值对黄精多糖提取率影响的响应面和等高线
Figure 7. Response surface and contours of the effect of extraction time and extraction pH on the extraction rate of P. sibiricum polysaccharide
图7. 提取时间与提取pH值对黄精多糖提取率影响的响应面和等高线
4.3. 体外抗氧化活性测定结果
以Trolox作为阳性对照,黄精多糖对DPPH自由基的清除能力如图8(A)所示。随着多糖溶液质量浓度的升高,其DPPH自由基清除能力逐渐增强,在质量浓度达到1.0 mg/mL时,清除能力接近阳性对照,但整体仍低于阳性对照。在ABTS+自由基清除实验中,黄精多糖的清除效果表现出浓度依赖性(图8(B)),当质量浓度为1.0 mg/mL时,清除率达到86.6%。此外,黄精多糖对羟基自由基和超氧阴离子自由基也表现出一定的清除能力(图8(C)、图8(D)),在1.0 mg/mL质量浓度下清除率最高,分别为47.3%和50.5%。
注:(
, n = 3)。
Figure 8. In vitro antioxidant activity of P. sibiricum polysaccharide
图8. 黄精多糖的体外抗氧化活性
注:(
, n = 3)。
Figure 9. In vitro hypoglycemic activity of P. sibiricum polysaccharide
图9. 黄精多糖的体外降血糖活性
4.4. 体外降血糖活性测定结果
如图9(A)所示,黄精多糖对α-葡萄糖苷酶具有浓度依赖性的抑制作用,在质量浓度为1.0 mg/mL时,抑制率达到32.9%,表明其具备一定的酶抑制能力,但整体抑制效果弱于阳性对照阿卡波糖。从图9(B)可以看出,黄精多糖对α-淀粉酶同样表现出抑制活性,在质量浓度为1.0 mg/mL时,抑制率最高,为56.8%,进一步证实其对α-淀粉酶也具有抑制能力。
5. 讨论
响应面分析法作为一种有效的工艺优化方法,已广泛应用于天然药物活性成分的提取工艺研究[24] [25]。本研究首先通过单因素试验确定了影响黄精总多糖提取的关键参数范围,继而采用Box-Behnken响应面设计建立了蒽酮–硫酸法测定黄精多糖含量的二次回归模型(R2 = 0.982)。方差分析表明,各因素对黄精多糖提取率的影响程度依次为:粉碎粒度 > 提取pH值 > 提取时间。在实际操作过程中,研究发现药材粉碎粒度过细,比表面积增大,易导致药材粉末在提取溶剂中发生团聚结块,溶出的多糖分子与药渣形成物理吸附的可能性增加,除多糖以外淀粉、果胶、色素等杂质也会大量溶出,以上因素均会降低多糖的提取率。另外,多糖的提取效果还会受到提取时间、高温加热、pH偏强碱性的影响,如多糖分子因发生糖苷键断裂、β-消除反应使其结构变化,继而因分子量减小导致后续目标成分的醇沉量降低。因此,在单因素实验的基础上,经响应面法优化的黄精多糖热回流提取法的最佳提取工艺参数为:粉碎粒度120目、提取时间2 h/次、提取次数2次、pH 8、水浴温度80℃。验证实验显示,在此条件下黄精多糖的提取率为(13.08 ± 0.42)%与模型预测值(13.01%)的相对误差 < 1%,证实了模型的可靠性。
多糖类成分易受提取温度、提取时间、酸碱性提取环境的影响,高温、强碱的条件易导致糖苷键的断裂、官能团的破坏,从而削弱其生理功能。本工艺采用温和且精准控制的条件,有效减少了多糖的降解与结构破坏,既可实现较高的提取率,也可在保证目标成分结构的同时保护与传统功效相契合的活性。本研究显示最佳工艺条件下获得的黄精多糖具有良好的抗氧化和降血糖活性。
本研究通过系统优化粉碎粒度、提取时间、pH及提取次数等关键参数,建立了以“温和碱性水提”为核心的提取工艺。该工艺将pH精确控制在8.0,在利用弱碱性软化细胞壁、促进溶出的同时,有效避免了强碱条件下β-消除反应导致的结构破坏,相比传统方法更能保持产物的天然活性。该工艺条件明确、重复性好,具备向规模化生产转化的潜力,为开发高活性黄精多糖功能产品提供了可靠的原料制备基础。
基金项目
青海民族大学大学生创新训练计划项目(DCXM-2025-048),遵KCTD(2025)90号,遵义市科合HZ字(2023)454号。
NOTES
*通讯作者。