原发性牙齿萌出障碍动物模型构建的研究现状

Research Status on the Establishment of Animal Models for Primary Failure of Tooth Eruption

摘要: 原发性牙齿萌出障碍(Primary Failure of Eruption, PFE)是一类导致牙列开HE的罕见病，临床只出现局部症状，无全身表现，主要与牙齿萌出机制异常有关。PFE是一种常染色体显性遗传病，甲状旁腺激素受体1 (Parathyroid Hormone Receptor 1, PTH1R)基因突变是其主要病因，多位学者以不同方式敲除PTH1R基因并构建出几种PFE小鼠动物模型作为研究之用，本文就有关PFE动物模型建模方法、建模思路、特点、局限性以及研究结果进行综合，为PFE致病机制研究提供参考。

Abstract: Primary failure of eruption (PFE) is a rare disorder leading to an anterior open bite, characterized by localized clinical symptoms without systemic manifestations, primarily associated with abnormal tooth eruption mechanisms. As an autosomal dominant genetic disease, the main etiology of PFE is mutation in the parathyroid hormone receptor 1 (PTH1R) gene. Several researchers have developed various PFE mouse models by knocking out the PTH1R gene using different approaches. This review comprehensively summarizes the modeling methods, strategies, features, limitations, and research outcomes of existing PFE animal models, aiming to provide a reference for investigating the pathogenic mechanisms of PFE.

1. 引言

Profit于1981年提出原发性牙齿萌出障碍(PFE)这一概念，定义为“萌出道畅通且没有固连的牙齿，由于牙齿萌出机制紊乱导致其部分或全部不能萌出，从而造成局部开HE”[1]。回顾相关文献[1]-[5]，可将PFE临床表现归纳为：1) 可累及恒牙和乳牙，第一磨牙最为常见，患牙远中牙齿会出现不同程度的受累；2) 可累及单侧或双侧，单侧多见；3) 患牙冠向萌出道无明显障碍；4) 仅有局部症状，无明显全身变化；5) 家族聚集性，有学者发现85% PFE患者有家族史；6) 正畸治疗无法将患牙调至合理位置，甚至会导致患牙发生固连。

研究发现PTH1R基因位点突变是PFE致病的重要原因[6]-[11]。PTH1R基因位于染色体3P22-22.1上，在骨骼、肾脏、牙源性间充质等器官组织中均有表达[12]，是牙根形成和牙齿萌出的关键因子。其编码的是甲状旁腺激素受体1 (PTH1R)或称甲状腺激素相关蛋白受体(Parathyroid Hormone-Related Protein Receptor, PPR)，是一种B类G蛋白偶联受体[13]。PTH1R的配体是甲状腺激素(Parathyroid Hormone, PTH)和甲状旁腺激素相关蛋白(Parathyroid Hormone-Related Protein, PTHrP)。PTHrP是一种局部作用的自分泌/旁分泌配体，牙齿发育过程中PTHrP在牙囊间充质细胞中有大量表达，参与细胞增殖、分化、上皮–间充质转化等过程[14]。受体和配体结合可激活第二信使信号系统：腺苷酸环化酶/蛋白激酶A通路和磷脂酶C/蛋白激酶C通路[15]。PTHrP-PTH1R信号通路可能单独或与其他主要信号通路如Wnt/β-catenin信号通路、Hedgehog信号通路、TGF-β/BMP信号通路相互作用来促进牙齿萌出和牙根形成。

为进一步了解PFE与PTH1R基因之间的关系，多位学者以不同方式敲除PTH1R基因的方法建立PFE动物模型，目的是以此来尝试阐明PFE发病机制。本文就有关PFE动物模型建立方法、建模思路、特点、局限性以及研究结果进行介绍，目的为PFE致病机制研究提供参考。

2. PTH1R基因全敲除的小鼠PFE动物模型

为研究PTH1R和PTHrP在早期骨发育中的功能作用以及其与Ihh (Indian Hedgehog，印度刺猬因子)在软骨细胞分化上的相互关系，Beate等[16]在小鼠上采用敲除PTH1R基因的方式来构建动物模型。建模方式基于同源重组原理，在小鼠胚胎干细胞中进行基因打靶敲除PTH1R基因的外显子E2 (编码PTH1R受体的大部分)，得到杂合敲除小鼠，再将杂合子小鼠进行杂交，从而获得PTH1R纯合敲除小鼠(简称为：PTH1R^−/−)。从实验结果上看，大多数PTH1R^−/−小鼠在妊娠中期死亡，死亡原因不清楚。为了延长纯合子小鼠的生存时间，Beate等将C57BL/6-129/SvJ品系的PTH1R^+/−子一代小鼠分别与亲代不同品系杂合子小鼠(包括C57BL/6-129/SvJ、MF-1和Black Swiss等品系)进行回交，发现仅与Black Swiss系小鼠回交才可延长PTH1R^−/−胚胎的生存时间，但得到的PTH1R^−/−小鼠生存时间并不长，大都于出生后几分钟内死亡。

通过对上述与Black Swiss系小鼠回交得到的PTH1R^−/−小鼠骨骼进行实验，Beate等发现与野生型小鼠比较，PTH1R^−/−小鼠出现软骨细胞增殖减少、过早分化凋亡和矿化加速的表现，导致生长板发育障碍和软骨内骨形成异常，整个骨骼明显缩小，与PTHrP^−/−小鼠[17]表型类似，表明PTH1R介导了PTHrP对软骨细胞分化的延迟作用。随后，Beate等对比了PTHrP、重组Shh (Sonic helgehog，音刺猬因子)及空白对照下分别培养下的PTH1R^−/−小鼠和正常小鼠胚胎的下肢，结果发现PTHrP或Shh可以抑制正常小鼠下肢中软骨细胞向肥大成熟的软骨细胞的分化，但PTHrP或Shh对PTHrP^−/−小鼠下肢的软骨细胞无明显作用，表明PTH1R是Ihh/PTHrP通路的靶点，从而得出结论：Ihh通过刺激软骨膜产生PTHrP，后者与软骨膜上的PTH1R受体结合，从而延迟生长板上软骨细胞的分化。

3. PTH1R条件性敲除小鼠PFE动物模型

3.1. Osx-PTH1R cKO小鼠

Osterix (成骨细胞特异性转录因子，Osx)主要在牙齿发育过程中的成牙本质细胞、牙囊细胞和牙槽骨成骨细胞表达[18]，参与调控牙骨质形成[19]。为了解牙源性间充质祖细胞中PTH1R-PTHrP信号在牙根形成和牙齿萌出过程中的作用，Ono等[20]采用cre/loxp重组酶系统条件性敲除阳性表达Osx (简称Osx⁺)的牙源性间充质祖细胞的PTH1R。Cre/loxp系统是近年来基因编辑最常用的工具之一，可以实现组织细胞的特异性基因编辑，本研究中Osx⁺细胞中的cre重组酶表达后可以特异性识别PTH1R基因中的loxp位点，切除位点间的DNA片段，实现PTH1R在Osx⁺细胞中的条件性敲除。参考文献[21]，其方法是将构建的Osx-cre::GFP小鼠[22] (Osx⁺细胞中表达cre::GFP融合蛋白，GFP：一种绿色荧光信号)与PTH1R基因外显子E1两侧修饰有loxp靶位点的纯合子小鼠[23] (简称：PTH1R flox小鼠)交配繁殖，得到PTH1R杂合敲除小鼠(Osx-cre::GFP; PTH1R^fl/+小鼠)，再将其与PTH1R flox小鼠杂交，从而得到PTH1R纯合敲除小鼠(Osx-cre::GFP; PTH1R^fl/fl)。

Ono等[20]将实验分为以下三组小鼠：PTH1R^fl/+,fl/fl (对照组)，Osx-cre::GFP; PTH1R^fl/+ (Osx-PTH1R cHet；杂合敲除组)和Osx-cre::GFP; PTH1R^fl/fl (Osx-PTH1R cKO；纯合敲除组)。但大多数PTH1R纯合敲除小鼠在断奶后出现不明原因死亡。结果表现为：三组小鼠从出生至第25天这段时间的体重表现为对照组、杂合敲除组和纯合敲除组小鼠体重呈现递减方式。对照组和杂合敲除组小鼠磨牙正常萌出，纯合敲除组小鼠磨牙出现萌出障碍，表现为PFE表型。出生后不同时间点的HE染色分析发现，杂合敲除组小鼠磨牙上皮根鞘周围的间充质祖细胞增殖减少、牙根缩短、牙周膜变薄且排列紊乱和牙骨质不规则。纯合敲除组小鼠磨牙上皮根鞘周围的牙源性间充质细胞出现增殖明显缺陷、牙根明显缩短、牙周膜消失、牙骨质与牙槽骨分界不清，有粘连的表现。以上结果说明PTH1R缺失会影响牙囊间充质祖细胞功能，也影响牙根与牙周组织形成以及牙齿萌出过程。Periostin (POSTN，牙周膜特异蛋白)免疫荧光染色发现对照组小鼠磨牙牙周膜中出现强烈的免疫荧光，杂合敲除组小鼠磨牙的免疫荧光染色强度和范围均较对照组减小，而纯合敲除组小鼠牙齿中几乎未观察到Periostin染色，表明牙囊间充质祖细胞中的PTH1R会影响牙周膜细胞表达Periostin，从而影响牙周膜细胞分化及代谢。抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-Resistant Acid Phosphatase, TRAP)染色结果为：牙根形成和牙齿萌出前后三组小鼠磨牙周围的TRAP⁺细胞的数目和分布均无显著差异。

Ono等还采用他莫昔芬诱导的creER-loxp重组酶系统进行细胞谱系追踪实验，探讨PTH1R信号缺失对Osx⁺牙囊间充质祖细胞的影响。creER/loxp系统除可以组织特异性敲除基因外，还可以通过他莫昔芬的给药时间控制cre重组酶介导的识别切割作用。方法是构建Osx-creER小鼠、R26R-tomato报告小鼠和PTH1R flox小鼠，通过杂交技术获得三重转基因小鼠(Osx-creER; R26R-tomato; PTH1R^fl/fl)。本研究是在小鼠出生后第3天注射他莫昔芬，时空性敲除PTH1R。实验分为Osx-PTH1R WT (野生型，对照组)和Osx-PTH1R tcKO (条件性纯合敲除组)小鼠，HE染色下发现纯合敲除组小鼠磨牙正常萌出，但牙根较对照组稍短，切片观察发现其牙骨质较对照组的明显增厚，且出现大量嵌入基质的牙骨质细胞。同时，纯合敲除组小鼠磨牙上皮根鞘周围的牙囊间充质祖细胞也出现增殖减少的趋势。为进一步探索PFE机制，Ono进行流式细胞术和qPCR，发现纯合敲除组Osx⁺细胞中PTH1R和Nfic (Nuclear Factor I/C，核因子I/C)表达下调，而osteopontin (Opn，骨钙素，一种位于骨、牙骨质、牙本质中的非胶原蛋白)表达上调。综上，PTH1R缺陷的Osx⁺牙根形成祖细胞向成牙骨质细胞分化加速，伴Nfic表达上调，导致正常形成无细胞牙骨质的牙根表面出现细胞牙骨质。

3.2. OC-PTH1R cKO小鼠；Dmp1-PTH1R cKO小鼠

基于上文提到的Osx-PTH1R cKO小鼠出现明显牙根缩短，Ono等[20]通过OC (Osteocalcin；骨钙素)-cre和Dmp1 (Dentin Matrix Acidic Phosphoprotein 1，牙本质基质蛋白1)-cre来探究牙根形成过程中PTH1R在已分化的矿化细胞中的特异性作用，通过对以下三组进行HE染色分析：PTH1R^fl/fl (对照组)、OC-cre; PTH1R^fl/fl (OC-PTH1R cKO)和Dmp1-cre; PTH1R^fl/fl (Dmp1-PTH1R cKO)，结果表明已分化基质产生细胞的PTH1R对牙根形成并非必需，但可能对成牙骨质细胞有直接影响。Ono等利用Col1a1-caPTH1R转基因(在Col1⁺细胞中激活PTH1R)小鼠来研究激活已分化基质产生细胞的PTH1R是否能够挽救Osx-PTH1R cKO小鼠的牙根截断表型，结果发现：在已分化产生基质细胞中，组成性激活PTH1R可挽救Osx-PTH1R cK0小鼠的牙冠表型，但不能挽救其牙根截断表型。实验表明在Osx⁺祖细胞分化为Col1⁺细胞之前，PTH1R信号对启动牙根形成至关重要。

3.3. Osx-HDAC4 cKO小鼠

HDAC (Histone Deacetylase，组蛋白去乙酰化酶)被认为可能是PTH1R-Gsα-CAMP-PKA通路下游的候选调节因子。[24] [25]研究[26]指出：HDAC4主要通过抑制Mef2c (Myocyte Enhancer Factor 2C，肌细胞特异性增强因子2C)和Runx2 (Runt-Related Transcription Factor 2，Runt相关转录因子2)两者表达来抑制软骨内成骨，影响骨折愈合。Takahashi等[27]通过RNA原位杂交技术发现：PTH1R条件性敲除小鼠磨牙牙囊细胞中Mef2c明显上调。同时，Ono等[20]通过流式细胞学发现HDAC4和HDAC5在Osx⁺牙周膜细胞和成牙骨质细胞中也出现表达。以上实验均提示，在牙根形成中HDAC4和PTH1R可能存在协同作用。

为了探讨在牙源性间充质祖细胞中的PTH1R信号传导和牙根形成过程中HDAC4是否有参与作用，Ono等[20]将PTH1R^+/−小鼠和HDAC4^+/−小鼠进行杂交，得到：PTH1R^+/+，HDAC4^+/+(WT)，PTH1R^+/−；HDAC4^+/+ (PTH1R-Het)，PTH1R^+/+；HDAC4^+/− (HDAC4-Het)和PTH1R^+/−；HDAC4^+/− (DHet) 4组小鼠，HE染色对比发现：PTH1R-Het和HDAC4-Het小鼠磨牙牙骨质增厚，DHet小鼠牙骨质明显增厚，且排列紊乱，偶出现牙骨质细胞嵌入基质中，与Osx-PTH1R cKO小鼠牙骨质表型类似，提示HDAC4很可能与PTH1R在牙根形成过程中存在协同效应。随后，Ono等建立了HDAC4^−/−小鼠和Osx-HDAC4 cKO小鼠，通过HE染色发现：两种小鼠均出现以上相似的牙骨质表型和牙根缩短，细胞增殖实验发现HDAC4的敲除会导致牙囊间充质细胞出现增殖减少趋势。HDAC4敲除一定程度上可以模拟PTH1R缺失导致的牙根截断和牙骨质表型，说明HDAC4可能是牙根形成祖细胞中PTH1R信号下游的调节分子，并推测小鼠中HDAC5可能补偿了HDAC4的缺失。

3.4. PTHrP-PTH1R cKO小鼠

基于他莫昔芬诱导的creER-loxp系统的时空特异性，为探讨PTH1R在阳性表达PTHrP的牙囊间充质祖细胞中细胞分化的作用及PFE发病机制，Takahashi等[14]采用PTHrP-creER和PTH1R-floxed等位基因在牙根形成时(出生后第3天，P3)条件性敲除PTHrP⁺细胞中的PTH1R，同时使用R26R-tdTomato报告基因追踪PTH1R缺陷的牙囊(dental follicle, DF)间充质祖细胞的命运。

Takahashi将小鼠分为以下几组：PTH1R^fl/fl；R26R^tdTomato/+ (对照组)，PTHrP-creER；PTH1R^fl/+；R26R^tdTomato/+ (DF-PTH1R cHet，杂合敲除组)和PTHrP-creER; PTH1R^fl/fl；R26R^tdTomato/+ (DF-PTH1R cKO，纯合敲除组)，分别于P3注射他莫昔芬，进行时空性敲除PTH1R。从大体观察、CT、三维建模、HE染色、免疫荧光染色和细胞谱系追踪实验等观察牙齿萌出情况、组织细胞的结构变化及牙囊间充质祖细胞细胞命运的异常转变，结果表现为：对照组和杂合敲除组小鼠磨牙正常萌出，而纯合敲除组小鼠第一磨牙大部分出现萌出障碍以及牙根明显缩短和弯曲，表现为PFE的特征性表现，HE染色排除了牙根-牙槽骨粘连导致萌出障碍这一可能性；Periostin免疫荧光染色发现纯合敲除组磨牙仅少数牙周膜细胞表达Periostin；抗酒石酸酸性磷酸酶染色结果与上述Ono研究的结果一致；细胞谱系追踪实验发现，在牙根形成和牙齿萌出过程中，对照组和杂合敲除组小鼠磨牙的PTHrP⁺牙囊细胞会分化为无细胞牙骨质上的成牙骨质细胞、牙周膜细胞和成骨细胞，而纯合敲除组小鼠磨牙的PTHrP⁺牙囊间充质祖细胞几乎未分化为无细胞牙骨质的成牙骨质细胞、牙周膜细胞和成骨细胞，相反，过早分化为成牙骨质样细胞，从而在牙根表面异位形成细胞牙骨质。

为解析以上现象出现的原因，在分子水平上，Takahashi等[14]通过RNA测序分析了PTH1R缺失下牙囊间充质祖细胞的基因表达情况，发现Mef2c和几个编码矿化调节因子的基因如Dmp1表达上调，表明PTH1R缺失可加快牙囊间充质祖细胞向成骨细胞/成牙骨质细胞分化。进一步的生信分析显示Mef2c可能是PTH1R缺陷导致牙囊间充质祖细胞加速分化为成骨细胞/成牙骨质细胞这一病理过程的关键因子。Takahashi通过流式细胞分析发现DF-PTH1R cKO磨牙的牙囊细胞中CD200 (又称OX2，一种I型跨膜糖蛋白)表达明显上调，因而Takahashi等分析了正常牙囊细胞分化过程中CD200的表达情况，发现在牙齿萌出和牙根形成过程中，PTHrP⁺牙囊细胞会分化为CD200^high的成牙骨质细胞和成骨细胞以及CD200^low的牙周膜细胞。

综上，PTHrP-PTH1R信号通过抑制Mef2c表达来抑制CD200和其他骨/牙骨质基质蛋白的过早上调，从而阻止牙囊间充质祖细胞过早分化为成牙骨质细胞而形成细胞牙骨质，维持正常细胞分化和牙周附着的正常形成。

3.5. Prx1-PTH1R cKO小鼠

Prx1 (Paried Related Homeobox 1，配对相关同源盒基因1)是一种间充质干细胞的特异性标志物[27]，在胚胎肢芽和颅颌面发育中高度表达[28]。Cui等[29]通过细胞谱系追踪发现Prx1⁺祖细胞位于切牙周围和磨牙基部的牙槽骨骨髓，切牙的牙囊和牙髓也存在。采用Prx1-cre；PTH1R^fl/fl系统条件性敲除PTH1R来研究牙萌出过程中PTH1R在牙源性间充质组织中的作用。实验成功构建了原发性牙齿萌出障碍模型并初步探索了PFE的发病机制，但不足之处是，Cui等构建的小鼠萌出障碍主要发生于前牙，并不能完全反映人类PFE的临床特征，后者主要发生于后牙。其次，小鼠切牙会一直持续萌出，其萌出情况与人类牙齿萌出大不相同。

实验分为以下两组：Prx1-cre；tdTomato^fl/+ (对照组)小鼠和Prx1-cre；PTH1R^fl/fl；tdTomato^fl/+ (纯合突变组)小鼠。Cui等[29]从μCT、HE染色和免疫荧光染色等手段观察牙齿萌出情况以及组织细胞结构的变化，结果表现为：突变小鼠出现切牙萌出障碍、磨牙萌出延迟。马松(Masson)染色发现突变切牙牙周膜变窄，排列紊乱；Periostin免疫荧光染色发现突变切牙牙周膜中Periostin表达减少并出现异位骨样组织，而突变磨牙牙周膜无明显异常。与Takahashi的实验结果不同的是，本研究发现对照组和突变组磨牙周围CD200的表达无明显差异。特别的是，本实验通过HE染色和μCT发现：突变小鼠下颌骨的牙槽骨骨量明显减少，Takavanich等[30]通过cre-loxp重组酶技术构建PTHrP⁺间充质细胞特异性PTH1R条件性敲除小鼠，其突变小鼠磨牙表现为PFE的特征，也出现根间牙槽骨高度显著降低。进一步，Cui等[29]采用组织形态测量术、qRT-PCR和免疫荧光染色等技术发现突变小鼠中的骨形成参数和成骨相关标志物表达明显减小，结果表明PTH1R缺失的间充质祖细胞的成骨分化受到抑制。qRT-PCR和TRAP染色结果发现对照组和突变组小鼠破骨能力无明显差异。

OMSCs (Orofacial Bone-Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells，颌骨骨髓间充质干细胞)可以分化为成骨、成脂和成软骨的细胞，具有多向分化潜能。Cui等[29]体外培养了OMSCs来研究PTH1R缺失导致牙槽骨骨量减少的分子机制。体外培养的OMSCs经成骨诱导后，通过实验发现突变OMSCs的ALP (Alkaline Phosphatase，碱性磷酸酶)和茜素红染色强度明显降低以及成骨相关因子表达减少，表明：突变小鼠的OMSCs的成骨向分化能力减弱。此外，Cui等[29]通过qPCR分析发现：与对照组相比，BMP/TGF-β通路的转录靶点(Tgfbr1、Tgfb1和BMP1)在突变小鼠中出现下调，而Wnt/β-catenin信号通路靶点保持不变，这提示：在OMSCs的成骨分化中，BMP/TGF-β信号和PTH1R信号可能存在相互作用。

4. 结语

原发性牙齿萌出障碍是一种表现为牙齿部分或完全不能萌出的罕见疾病，建立动物模型能有效阐明PFE的发病机制。目前PFE动物模型的构建还有很大的进步空间，本文介绍了不同类型的PTH1R基因敲除小鼠，尽管构建的小鼠PTH1R缺失与人类PTH1R基因突变在形式上存在一定差异，但也在一定程度上可以作为探索或了解PFE可能致病机制的工具。

需指出的是，小鼠作为模型生物在研究牙齿萌出机制时存在一定的局限性，尤其是其切牙具有持续生长的特性，这与人类及大多数哺乳动物的牙列发育模式不同，可能干扰对 PFE 中牙齿萌出机制的准确解读。相比之下，猪、犬等大动物的牙列结构更接近人类，能更真实地模拟萌出表型，但其模型构建难度较高。

综上，现有研究为理解PFE奠定了初步基础，未来需进一步整合小鼠与大动物模型的优势，进一步推动疾病研究与治疗策略的发展。

NOTES

^*通讯作者。