中性粒细胞胞外诱捕网介导的急性缺血性卒中替奈普酶抵抗机制与昼夜节律干预策略的研究进展

Mechanisms of NETs-Mediated Tenecteplase Resistance in Acute Ischemic Stroke and Advances in Chronotherapeutic Strategies

摘要: 急性缺血性卒中(Acute Ischemic Stroke, AIS)的药物再灌注治疗正处于从传统的阿替普酶(rt-PA)向替奈普酶(Tenecteplase, TNK)转变的关键时期。尽管TNK凭借其经过分子工程改良的纤维蛋白特异性和药代动力学特性，展现出优于前一代药物的潜能，但在临床实践中仍然有部分患者表现出显著的“溶栓抵抗”。近年来的研究发现，血栓内部不仅包含纤维蛋白网，还富含一种被称为“免疫血栓”骨架的中性粒细胞胞外诱捕网(Neutrophil Extracellular Traps, NETs)。这种由DNA与蛋白酶交织而成的网状结构，在物理层面阻碍了溶栓药物的渗透，并通过生化机制降低了TNK的药效。最新的时间生物学研究显示，中性粒细胞活化及NETs分泌受Bmal1/CXCR4等多种生物钟基因调控，周期具有明显昼夜波动趋势，说明卒中的严重程度和治疗效果可能具有时间依赖性。本文旨在系统梳理NETs导致TNK溶栓抵抗的生物学机制，阐述免疫系统的昼夜节律对血栓病理的影响，并探讨利用DNase-1进行辅助溶栓及基于时间维度的精准治疗策略，为提升AIS的临床再通率提供理论参考。

Abstract: Pharmacological reperfusion therapy for Acute Ischemic Stroke (AIS) is currently undergoing a pivotal transition from the traditional alteplase (rt-PA) to tenecteplase (TNK). Although TNK exhibits superior potential compared to its predecessor—owing to its bioengineered fibrin specificity and optimized pharmacokinetics—a significant subset of patients still manifests “thrombolysis resistance” in clinical practice. Recent investigations have revealed that thrombi are composed not only of a fibrin mesh but are also enriched with Neutrophil Extracellular Traps (NETs), which serve as the scaffold of “immunothrombosis.” This meshwork, interwoven with DNA and proteases, physically impedes the penetration of thrombolytic agents and biochemically attenuates the efficacy of TNK. Emerging chronobiological research indicates that neutrophil activation and NETs secretion are governed by various circadian clock genes, such as Bmal1 and CXCR4, exhibiting distinct diurnal oscillations. This suggests that the severity of stroke and therapeutic responsiveness may be time-dependent. This review aims to systematically elucidate the biological mechanisms by which NETs induce TNK resistance, describe the impact of immune circadian rhythms on thrombus pathology, and explore adjuvant thrombolytic approaches using DNase-1 as well as chronotherapy-based precision medicine strategies. Ultimately, this work seeks to provide a theoretical reference for enhancing clinical recanalization rates in AIS.

1. 引言

急性缺血性卒中(AIS)作为全球范围内致死致残的首要病因之一，救治重点一直是“时间”和“再通”，治疗的根本目的是让缺血半暗带得到挽救，从而在脑组织发生完全性梗死前恢复其血流灌注。在过去的几十年里，药物溶栓一直是AIS治疗的基石[1]。尽管近年来血管内治疗技术飞速发展，但静脉溶栓凭借其便捷性、普适性和对非大血管闭塞患者的有效性，依然是临床一线的首选方案。但随着药物应用的普及，临床医生发现单纯依赖传统的溶栓药物往往难以应对复杂构成的血栓，特别是伴有高炎症负荷的病人，这促使学界开始寻找影响溶栓效率的深层机制。

1.1. 溶栓药物的进化史

自1996年重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA，阿替普酶)获批以来，它长期占据着AIS药物治疗的统治地位。但rt-PA并非完美，其半衰期短、需要持续静脉滴注且对纤维蛋白特异性有限等缺点一直是临床应用的痛点。为了克服这些局限，蛋白质工程技术催生了替奈普酶(TNK)——一种由t-PA分子经过三处关键的氨基酸定点修饰而来的第三代溶栓剂。这些微观结构的改变带来了宏观药理特性的巨大变化。T103N的引入和N117Q的移除改变了分子的糖基化模式，这两处氨基酸的改变让肝脏对药物的清除率大大降低，将TNK的血浆半衰期显著延长至20~24分钟[2]，是rt-PA的4倍以上，使得TNK可以实现“单次静脉团注”，即在5~10秒内完成给药，很大程度上简化了给药流程，缩短了从入院到治疗(DNT)的时间[3]。KHRR296-299AAAA的四丙氨酸替换，使得TNK对血浆中PAI-1 (纤溶酶原激活物抑制剂-1)的耐受性提高了80倍，同时其对血栓部位纤维蛋白的亲和力(特异性)比rt-PA高出14倍[4]。因此TNK能更精准地“追踪”血栓，减少对全身凝血系统的干扰，从理论上降低了全身出血的风险。

近年来由多项大规模RCT如加拿大的AcT试验[5]、中国的TRACE-2试验[6]以及英国的ATTEST-2试验[7]等的结果显示，与rt-PA相比，TNK用于AIS的溶栓治疗并不劣于rt-PA，并且在一些指标上优于rt-PA [8]。这些高等级循证医学证据正推动着全球卒中治疗指南的更新[9] [10]，TNK有望成为新时代的标准溶栓药物。

1.2. 溶栓治疗中的溶栓抵抗

虽然TNK在药理学上表现优异，但在真实世界的临床应用中仍面临着一个不容忽视的困境，仍有约80%的大血管闭塞的患者在接受足量TNK治疗后没能在早期实现血管再通[11]。

长期以来传统的血栓学理论倾向于将血栓视为红细胞与血小板被纤维蛋白网罗的简单聚合体，因此溶栓治疗的靶点较为单一地聚焦于降解纤维蛋白，这种“一维”的治疗策略低估了血栓的生物学复杂性。最新的病理研究结果提示，缺血性卒中本质上是一种“免疫–血栓”炎症反应，在这种病理环境下，血栓内部积聚了大量的先天免疫细胞，特别是中性粒细胞。这些免疫细胞并不是旁观者，而是积极的参与者。Mengozzi L等人[12]的研究形象地将中性粒细胞及其释放的衍生物称为血栓中的“暗物质”，中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)是其中的核心主角。这些“暗物质”成分在常规病理染色中常被人忽视，但实际上它们参与构成血栓极其坚固的内部支架，从而导致了对以纤维蛋白为靶点的TNK药物的天然抵抗。这种原本用于捕获病原体的防御机制[13]，在缺血性脑损伤的无菌性炎症环境下发生了病理性的异化[14]，成为了阻碍药物溶栓的坚固壁垒。

但NETs并非是TNK的溶栓抵抗的唯一机制，血小板、血管性血友病因子(vWF)等亦是抗纤溶的主要成分[15]，且血栓的成分不同，对于TNK的反应程度也存在明显差异[16]。对于TNK抵抗血栓，机械取栓(MT)仍是血管再通的最重要手段[17]，即使TNK不能完全溶解血栓，它也可能溶解血栓周边的疏松区域，从而松解血栓与血管壁的粘连，降低MT的难度和次数。

本文通过综述NETs导致TNK溶栓抵抗的生物学机制、免疫系统的昼夜节律对血栓病理的影响，探讨利用DNase-1进行辅助溶栓及基于时间维度的精准治疗策略，旨在为提升AIS的临床再通率提供理论参考。

2. 免疫血栓与NETs

为了理解溶栓抵抗，必须深入微观世界，剖析免疫系统如何介入血栓的构建。

2.1. NETs的形成

中性粒细胞是人体应对急性损伤的“急先锋”，在缺血发生后的数小时内即可大量浸润脑组织。在缺血缺氧、炎症因子及活化血小板的共同刺激下，中性粒细胞会启动一种独特的程序性死亡方式——NETosis，向胞外释放NETs [18]。这一过程不同于凋亡或坏死，是一种主动的防御机制。其生化路径主要依赖于钙离子内流[19]触发的肽酰基精氨酸脱亚氨酶4 (PAD4)的激活。PAD4入核后会对组蛋白H3 (特别是精氨酸位点)进行瓜氨酸化修饰，这种修饰移除了组蛋白的正电荷，破坏了其与带负电DNA之间的静电吸附力，导致原本高度折叠致密的染色质瞬间解螺旋并变得松散膨胀[20]，这也将导致核膜破裂，松散的DNA骨架在胞质中吸附大量具有细胞毒性的颗粒蛋白(如中性粒细胞弹性蛋白酶NE、髓过氧化物酶MPO)，最终突破细胞膜喷射而出。这些释放到胞外的DNA网状结构原本是为了捕获细菌[13]，但在血管内它们却成为了粘附血小板、红细胞的“强力胶水”，极大地促进了血栓的生长与稳定。

2.2. 血栓的微观病理学发现

随着高分辨率显微成像技术的应用，有研究发现血栓并不是均质的“果冻”[21]，而是具有高度空间异质性的实体，且不同病因的血栓成分迥异。心源性血栓、静脉血栓通常富含NETs、血小板和vWF因子，红细胞相对较少，即“白栓”；而动脉粥样硬化性血栓则多为富含红细胞的“红栓”[21]。针对血栓的形态学分析发现，红栓对TNK高度敏感，其疏松的网状结构允许药物迅速渗透，且富含纤维蛋白底物，易于溶解[16] [17]。而白栓常呈现出一种特殊的“核–壳”结构。血栓中央即“核”主要是红细胞组成，血栓的外表面即“壳”主要由压缩的血小板、vWF因子和高密度的NETs纤维交织而成，血栓的“外壳”将药物隔绝在外。实验数据显示，这类血栓在经过TNK处理后，虽然部分纤维蛋白被溶解，但仍残留有白色的、富含DNA的NETs [22]。这表明在TNK治疗下的NETs比纤维蛋白更难被降解，它是导致血管残留闭塞的关键残留物。

3. NETs介导替奈普酶抵抗的三重机制

NETs导致TNK溶栓失败并非巧合，而是基于其独特的生物物理与生物化学特性。其致病机理可以归纳为物理、化学与底物修饰三个维度。

3.1. 物理屏障与空间位阻效应

TNK作为一种大分子糖蛋白，分子量约为65 kDa，要达到溶栓效果，需要与血栓中纤维蛋白接触。而NETs形成的DNA纤维网孔径极小，且这种DNA纤维网密度远远大于常规的纤维蛋白网[22]。这种致密的网状结构在血栓表面构成了一道物理屏障，产生了“空间位阻效应”。对于TNK分子来说，这层屏障就像致密的筛网一样，将它拦截在血栓的最外层，没办法向血栓深处渗透。这种渗透限制导致药物只能在血栓表面非常有限的区域发挥作用，而无法崩解血栓的核心。这也是为什么临床上增加TNK剂量却无法提高疗效，并且还会增加出血风险的原因——药物根本无法到达靶点。

3.2. 酶的劫持与非特异性吸附

除了被动的物理阻隔，NETs还通过化学手段主动消耗药物。NETs骨架由DNA构成，DNA是强负电荷聚合物。这种电荷特性使其成为一个巨大的离子交换树脂，能够非特异性地吸附带有正电荷区域的蛋白质。研究证实，t-PA及其衍生物TNK容易被DNA网格非特异性地吸附[15]。这种现象被称为“酶的劫持”或“滴定效应”。大量的TNK分子被困在DNA网上，无法结合到其真正的底物纤维蛋白上。而且NETs上镶嵌的组蛋白本身也是纤溶酶的竞争性抑制剂，它们能结合并中和刚刚生成的纤溶酶，使其在降解纤维蛋白之前就失去活性[23]。这种化学层面的“诱导与灭活”，极大地降低了局部有效药物浓度[24]。

3.3. 底物修饰与结构刚性化

第三重机制在于NETs改变了血栓本身的材质。在凝血因子XIIIa的催化下，NETs中的组蛋白可以与纤维蛋白发生共价交联，形成“组蛋白–纤维蛋白”杂交复合体[23]。这种杂交纤维比单纯的纤维蛋白更粗、更硬，且具有极强的抗酶解能力。组蛋白的掺入似乎掩盖了纤维蛋白上的赖氨酸结合位点，使得TNK难以识别底物。此外，NETs增加了血栓的机械硬度，使其更难被血流剪切力冲刷破碎[24]。体外实验表明，富含NETs的血栓，溶解其所需的时间是普通血栓的数倍[15]，且往往只能实现部分溶解。

4. 溶栓治疗的昼夜节律

既往的卒中治疗方案大多忽略了发病时间点对病理生理的影响。近年来的多项研究引入了“时间生物学”视角，揭示了免疫系统的昼夜节律特征。

4.1. 中性粒细胞的生物钟震荡

中性粒细胞并不是整日维持恒定的功能状态的，活性由生物钟基因(如Bmal1、CXCR4)精密调控[25] [26]，呈现出24小时的周期性震荡。Vázquez-Reyes等人[27]的研究发现，在机体“非活跃期”(相当于人类的夜间至次日清晨)，循环中的中性粒细胞处于一种“预激化”状态，细胞内的生物钟基因表达谱发生偏移，细胞表型呈现出“促NETs化”的特点，即此时“非活跃期”的中性粒细胞对缺血性的刺激更为敏感，并且更容易发生脱颗粒反应而导致释放大量NETs。在“活跃期”(相当于人类的白天)，中性粒细胞则表现得比较“温和”，NETs释放能力也相对较弱。

4.2. 卒中结局的昼夜差异

这种免疫节律直接映射到了卒中的临床结局上。流行病学数据长期以来一直提示，清晨或夜间发病的卒中患者预后往往较差[28] [29]，且对溶栓的反应不佳。现在的分子生物学证据为此提供了合理解释。既往研究表明，缺血性脑卒中会引起强烈的炎症反应，导致低灌注区的中性粒细胞浸润[30]，而中性粒细胞的浸润又会加重神经元的损伤[31]。实验表明，在非活跃期(高NETs时段)诱导的卒中，其最终梗死体积显著大于活跃期诱导的卒中[27]，充分说明了中性粒细胞的生物钟对于卒中的结局有着重要影响。

4.3. 治疗的时间窗效应

既然病理机制随时间波动，那么对应的治疗策略也应作出调整。研究人员发现，针对NETs的干预同样具备“时间依赖性疗效”。在动物模型[32]中，当非活跃期给予抗NETs药物(如DNase-1)，因为此时体内的NETs负荷很高，药物起效明显，可以明显减少梗死体积和改善神经功能。但是当在活跃期(低NETs基线)给予同等剂量的药物，药效则变得微乎其微。该发现有重要的临床转化意义，提示未来的溶栓治疗可能需要根据患者的发病时刻来决定是否联用抗NETs药物，从而实现基于时间维度的精准医疗。

5. 基于NETs靶点的辅助溶栓治疗

鉴于NETs是TNK抵抗的重要物理与生化屏障，且具有明确的时间节律，未来的药物研发应更加注重如何打破这一屏障，辅助TNK发挥效能。

5.1. DNase-1与NETs靶向干预

脱氧核糖核酸酶-I (DNase-1)是目前研究最深入的NETs靶向药物。它是一种已经在临床上用于治疗囊性纤维化的成熟药物(Dornase Alfa)，并且已有研究证实了其安全性[33]。在辅助溶栓的场景下，DNase-1的作用机制是特异性水解NETs的DNA骨架。一旦DNA骨架被切断，附着其上的组蛋白和酶类也将会随之散落，原本致密的血栓外壳瞬间瓦解。这不仅消除了阻挡TNK渗透的物理屏障，还释放了被DNA吸附的溶栓药物，逆转了“滴定效应”。Xu等人[22]的体外模型研究表明，TNK与DNase-1联用能产生强大的协同效应，它们可以将血栓溶解率提高数倍，且未显著增加出血风险。

目前，旨在评估DNase-1辅助TNK溶栓疗效的II期临床试验(如EXTEND-IA DNase)正在进行中，其采用了贝叶斯自适应设计，试图寻找最佳的药物配比。如果能证实它的安全与有效性，这将是首个针对血栓“免疫成分”的联合溶栓疗法。

5.2. PAD4抑制剂与NETs源头阻断

不同于事后降解(DNase-1)，从源头阻断NETs形成也是备受关注的策略。PAD4是NETs形成的关键限速酶[34]，小分子PAD4抑制剂(如GSK484及其衍生物)能够阻止组蛋白的瓜氨酸化，从根本上抑制染色质的解螺旋和NETs的释放[35]。相较于DNase-1，PAD4抑制剂的优势在于其可能具有更广泛的血管保护作用，不仅能减少大血管内的血栓负荷，还能防止微循环中的中性粒细胞粘附和微血栓形成[36]。但此类药物目前的研发多处于临床前阶段，其作为急性期用药的起效速度及对免疫系统的长期影响仍需进一步评估。

5.3. 秋水仙碱与微管依赖性NETs抑制

秋水仙碱作为一种应用较早的抗炎药，近年来在心血管领域表现突出。它通过抑制微管聚合，不仅能阻断中性粒细胞的趋化游走，还能干扰NETosis所需的细胞骨架重排，从而减少NETs的生成[37]。在脑血管领域，CONVINCE [38]和CHANCE-3 [39]试验评估了秋水仙碱在二级预防中的作用，虽然未得到积极的结论，但是其抗NETs特性可能有助于在急性期减轻再灌注损伤，目前仍需专门的急性期的试验来证实。

6. 精准医疗路径展望

基于上述血栓成分的异质性和昼夜节律的差异的阐述，未来的AIS溶栓药物治疗流程可能会发生改变，治疗的模式需要向精准医疗方向进行转变。

AIS的治疗长期以来遵循“时间就是大脑”的原则，其中进门至溶栓时间(DNT)是衡量卒中中心救治效率的核心指标。现有的流行病学与病理生理学证据表明，DNT的每一分钟延迟都伴随着不可逆的神经元丢失与临床预后的显著恶化[40]。近年来，全球卒中指南逐渐将DNT的目标从60分钟压缩至45分钟甚至30分钟。30分钟内接受溶栓的患者，其3个月mRS评分0~2分的几率是60分钟以上组的2.35倍(OR值2.35，95% CI 1.26~4.39) [41]。理想的精准治疗流程不应以延长DNT作为代价。目前急诊卒中绿色通道(Code Stroke)的常规流程为接诊–抽血–CT–等待结果–溶栓，未来理想的精准治疗流程则需要利用CT检查不可压缩的物理时间(通常15~25分钟)，通过床旁快速检测(POCT)技术检测血液中特异性的NETs生物标志物(如瓜氨酸化组蛋白H3Cit或MPO-DNA复合物)，在等待CT结果与溶栓前的时间快速评估患者的“免疫血栓负荷”及可能的预后情况[42]。对于在夜间发病或生物标志物水平极高的患者，采用“TNK + DNase-1”或“TNK + 抗炎药物”的联合方案；而对于低负荷患者，单纯TNK治疗可能已足够。这种分层治疗策略将最大化疗效并最小化药物暴露风险。

必须强调的是，时间对于挽救缺血脑组织极其重要。如果POCT检测耗时超过了CT检查的时间窗而导致DNT被迫延长，那么检测带来的精准获益很有可能会被时间延误造成的神经元损伤(每分钟190万个)所抵消[40] [43]。因此只有当NETs生物标志物检测能实现“零延误”嵌入现有急救流程时，其临床应用才具备真正的卫生经济学价值，否则在现有技术条件下，经验性快速溶栓仍是首选策略。

7. 总结

综上，NETs作为血栓内部的“暗物质”，通过构建物理屏障、化学劫持及底物修饰等复杂机制，构成了TNK疗效的天花板；且这一病理过程受到昼夜节律的深刻影响，呈现出非活跃期高发的特征。打破这一僵局的关键在于将治疗的视野从单纯的“溶栓”扩展到“免疫溶栓”，通过引入DNase-1等靶向NETs的药物，并结合时间生物学规律进行择时治疗，我们有望攻克TNK抵抗这一临床难题，进一步改善缺血性卒中患者的预后。

NOTES

^*通讯作者。