基于网络药理学探讨苦茶碱治疗特应性皮炎的作用机制

Exploring the Mechanism of Action of Theacrine in Treating Atopic Dermatitis Based on Network Pharmacology

摘要: 目的：以网络药理学为基础，探索苦茶碱(Theacrine)治疗特应性皮炎(Atopic dermatitis, AD)的潜在靶点并分析其作用机制。方法：通过Swiss Taget Predictions数据库探索苦茶碱的潜在作用靶点。利用GeneCards和OMIM数据库搜索与特应性皮炎相关的靶点。将AD疾病靶点数据合并去重以后苦茶碱靶点导入jvenn绘制韦恩图，从而获得交集靶点。将交集靶点导入STRING构建苦茶碱与AD的蛋白互作网络图，并通过Cytoscape3.7.2软件构建PPI网络。进行基因本体论分析(GO)和基于KEGG数据库的通路富集分析。结果：共筛选出苦茶碱潜在作用靶点68个；特应性皮炎疾病靶点2158个；交集靶点23个；其中CTSS、SYK、BACE1、HDAC1、ADORA2A为蛋白互作网络图筛选出的苦茶碱治疗特应性皮炎的核心靶点；通过P值 < 0.01，GO富集分析获得738个生物学过程、70个细胞组分、70个分子功能；KEGG富集分析获得23条信号通路。结论：苦茶碱可能是通过CTSS、SYK、BACE1、HDAC1、ADORA2A等关键基因靶点，经Notch信号通路、神经活性配体信号传导通路、类固醇激素生物合成通路、FcεRI信号通路等发挥治疗特应性皮炎的作用。

Abstract: Objective: To investigate the mechanism of action of theacrine in treating atopic dermatitis (AD) using network pharmacology. Method: Explore potential targets for theacrine using the Swiss Target Predictions database. Search for targets associated with atopic dermatitis using the GeneCards and OMIM databases. After merging and deduping AD disease target data, the theobromine targets were imported into JVenn to generate a Venn diagram, thereby identifying the intersection targets. Import the intersecting targets into STRING to construct a protein-protein interaction (PPI) network diagram between theobromine and AD. Using Cytoscape 3.7.2 software, build the PPI network. Perform gene ontology (GO) analysis and pathway enrichment analysis based on the KEGG database. Results: A total of 68 potential targets for theacrine and 2158 targets for atopic dermatitis were identified. The intersection yielded 23 common targets, among which CTSS, SYK, BACE1, HDAC1, and ADORA2A were selected as core targets for theobromine treatment of atopic dermatitis based on the protein interaction network analysis. With a P-value < 0.01, GO enrichment analysis identified 738 biological processes, 70 cellular components, and 70 molecular functions; KEGG enrichment analysis identified 23 signaling pathways. Conclusion: theacrine may exert its therapeutic effects on atopic dermatitis by targeting key genes such as CTSS, SYK, BACE1, HDAC1, ADORA2A, acting through pathways including the Notch signaling pathway, neuroactive ligand-signaling pathway, steroid hormone biosynthesis pathway, and FcεRI signaling pathway.

1. 引言

特应性皮炎(Atopic Dermatitis)是一种常见的、慢性、复发性、炎症性的皮肤疾病。其临床特征为瘙痒性、干燥性红斑鳞屑，其中剧烈瘙痒为本病最核心也是最突出和最困扰患者的症状。AD在儿童中患病率达到约20%，成人中患病率约为1%~3%，女性患者居多[1]。尽管AD在非致病性疾病中仅排名15位，但按伤残调整寿命年(DALY)衡量，AD疾病负担在皮肤病中是最高的[2]。因其病程反复，AD病人往往需要长期接受治疗，目前度普利尤单抗已被证明可以缓解AD患者的症状，JAK1和JAK3等生物制剂也被证明治疗有效[3]，但因其价格高昂，目前临床上仍以皮质类固醇激素作为一线治疗药物。但不论是常规激素治疗还是生物制剂仍然存在效果不佳、复发率高的问题，并伴有一定的副作用。因此，更为安全有效且价格低廉的AD治疗药物仍为临床所需。

苦茶碱(Theacrine)即1,3,7,9-四甲基尿酸，是一种生物嘌呤碱[4]，来自于我国西南地区一种特殊的苦茶树，具有减轻炎症、抗氧化、抗抑郁、提高认知、改善脂质代谢等多种作用。研究发现苦茶碱通过上调SIRT3激活FOXO3a/Parkin通路，抑制咪喹莫特诱导的银屑病小鼠的皮肤炎症反应[5]。通过抑制IL-6和激活TGF-β/SMAD通路发挥了优异的抗关节炎作用[6]。由此我们思考苦茶碱是否会对AD这种慢性炎症性皮肤病有治疗效果。

因此，在本研究中我们运用网络药理学方法预测苦茶碱治疗AD的潜在靶点，并探究其关键通路。从而为中医药治疗AD提供一定理论基础。

2. 材料与方法

2.1. 苦茶碱作用靶点筛选

以苦茶碱“Theacrine”为关键字使用PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)检索到苦茶碱SMILES号为：CN1C2=C(N(C1=O)C)N(C(=O)N(C2=O)C)C，将该SMILES ID号输入Swiss数据库中 (https://www.swisstargetprediction.ch/)，物种选择“Homo sapiens”，将所获得的数据导出CVS格式文件，并筛选出Probability ≥ 0的苦茶碱成分靶点。

2.2. 特应性皮炎疾病靶点的预测

以特应性皮炎“Atopic Dermatitis”使用Genecard数据库(http://www.genecards.org/)和OMIM数据库(https://www.omim.org/)进行检索，将数据合并去重，筛选出特应性皮炎的疾病靶点。

2.3. 苦茶碱治疗特应性皮炎潜在作用靶点韦恩图分析

将苦茶碱成分靶点和特应性皮炎疾病靶点输入Jvenn中取交集并绘制韦恩图。

2.4. PPI蛋白互作网络的构建及核心靶点筛选

将2.2中获得的交集靶蛋白输入String数据库(https://string-db.org/)，构建苦茶碱和特应性皮炎的蛋白质–蛋白质相互作用网络图。将该结果导入Cytoscape 3.10.3软件中筛选出核心靶点并进行可视化处理。

2.5. GO分析与KEGG通路富集分析

利用微生信在线分析平台(https://www.bioinformatics.com.cn)。导入核心靶点后基因本体论分析(GO)和基于KEGG数据库的通路富集分析。

3. 结果与分析

3.1. 苦茶碱主要有效成分及特应性皮炎相关靶点分析

通过Swiss Target Prediction数据库检索苦茶碱，筛选出Probability ≥ 0的基因靶点68个。检索GeneCards和OMIM数据库获得特应性皮炎相关靶点2158个，将疾病靶点与68个药物靶点交集得到23个共靶点。如图1。

Figure 1. Target Venn diagram of theacrine-atopic dermatitis

图1. 苦茶碱–特应性皮炎韦恩图

3.2. PPI网络构建及核心靶点筛选

将23个交集靶点导入STRING数据库构建PPI网络图，如图2，共有23个节点、76条边。并将结果导入Cytoscape3.10.3软件，构建苦茶碱–特应性皮炎核心靶点网络，如图3。

Figure 2. PPI network of theacrine treatment atopic dermatitis

图2. 苦茶碱–特应性皮炎PPI网络

Figure 3. Key gene targets of theacrine treatment atopic dermatitis

图3. 苦茶碱–特应性皮炎核心靶点

3.3. GO富集分析

将23个交集靶点输入微生信在线分析网站，共获得23个靶点的878条GO注释，其中738条与生物过程(Biological process, BP)有关、70条与细胞组分(Cellular component, CC)有关，70条与分子功能(Molecular function, MF)有关。结果显示，在生物过程中，包含G蛋白偶联腺苷酸受体信号传导通路、G蛋白偶联的嘌呤能受体信号传导通路、膜蛋白胞外域蛋白水解、膜蛋白蛋白水解、β淀粉样蛋白形成过程、β淀粉样蛋白代谢过程、淀粉样前体蛋白分解代谢过程、有机酸转运调控过程、信号释放过程、淀粉样前体蛋白代谢过程。细胞组分涵盖突触前膜的整合和内在成分、内溶酶体、突触膜的整合和内在成分、前沿膜、早期吞噬体、纤毛根丝、吞噬囊泡、细胞基底部分、轴膜、突触前膜。分子功能包括天冬氨酸型内肽酶活性、天冬氨酸型肽酶活性、半胱氨酸型内肽酶活性、水解酶活性、磷酸二酯水解酶活性、神经递质受体活性、半胱氨酸型肽酶活性、支架蛋白结合，如图4。

Figure 4. GO enrichment analysis results for theacrine treatment targets in atopic dermatitis

图4. 苦茶碱治疗特应性皮炎靶点GO富集分析结果

3.6. KEGG通路分析

将23个交集靶点输入微生信在线分析网站进行KEGG富集分析，共富集出23条通路。这些通路涵盖了Notch信号通路、神经活性配体信号传导通路、神经活性配体–受体相互作用通路、类固醇激素生物合成通路、FcℇRI信号通路、以及阿尔兹海默病、结核病、酒精中毒、爱泼斯坦–巴尔病毒感染等信号通路。如图5。

Figure 5. KEGG enrichment analysis results for theacrine treatment targets in atopic dermatitis

图5. 苦茶碱治疗特应性皮炎靶点KEGG富集分析结果

4. 讨论

研究发现，苦茶碱通过抑制NLRP3/Caspase-1炎症小体激活，从而减轻脓毒症引起的肾损伤[7]。苦茶碱可以通过减少角化过度和棘层增厚、减少Ki67阳性细胞；上调角蛋白KRT1水平，降低KRT6水平；上调LC3-II/LC3-I比值和Beclin1水平，同时降低P62水平，增加自噬；减少CD4阳性细胞，并抑制Th17和Th1细胞的活化；从而减轻银屑病样小鼠的皮肤损伤[8]。研究表明，Th2信号在特应性皮炎早期阶段占主导地位，而Th2向Th1的转变会促进疾病的慢性化[9]。因此，我们推测苦茶碱可以通过抗炎、调节细胞功能在治疗特应性皮炎中发挥作用。

苦茶碱–特应性皮炎核心作用靶点分析提示CTSS、SYK、BACE1、HDAC1、ADORA2A等关键基因靶点在苦茶碱治疗特应性皮炎中发挥作用。CTSS是一种分泌型蛋白酶，主要作用于水解多余的和受损的蛋白质，同时CTSS也有抗原加工和抗原呈递作用[10]。研究发现，CTSS在人角质形成细胞中经干扰素-γ刺激后选择性上调，从而引起特应性皮炎等炎症性疾病瘙痒感的产生[11]。据报道，SFII通过抑制CTSS的表达，可显著缓解AD患者的瘙痒症状[12]。同时，CTSS在皮肤伤口愈合中起着关键作用，其过表达是瘢痕疙瘩形成的关键因素[13]。CTSS也是树突状细胞的标志物，其在黑素细胞中的表达是白癜风发病机制中重要的一环[14]。SYK是一种非受体型络氨酸激酶，其关键作用是连接免疫受体和下游的信号通路；其在AD的发生发展中扮演着重要角色，SYK抑制剂ASN002抑制CD₃⁺ T细胞和CD11_c⁺树突状细胞的浸润，改善AD患者表皮增生、FLG、FLG2和CLDN23的表达[15]。BACE1是一种跨膜天冬氨酸蛋白酶，其在神经发育、髓鞘形成与维持等方面发挥着重要作用。研究表明，BACE1与UVB诱导的光老化密切相关，其在光老化皮肤中表达显著升高[16]。同时，BACE1APP的裂解作用使Aβ42高表达会促进脂溢性角化病的发生[17]。在一项皮肤炎症与神经退行性病变的研究中发现，特应性皮炎患者患痴呆症的风险比非特应性皮炎患者高出27%。而这与FLG (编码丝聚蛋白，一种负责表皮保湿和屏障稳定的蛋白)和BACE1相互作用有关[18]。HDAC1即组蛋白去乙酰化酶1，据报道，Caspase1激活的GSDMD通过HDAC1通过降低FLG启动子区域的组蛋白乙酰化水平来降低FLG表达，并减弱KCTD6介导的HDAC1降解来抑制特应性皮炎中的角质形成细胞分化[19]。ADORA2A编码腺苷A2A受体，是G蛋白偶联受体家族中高亲和力腺苷受体，其在免疫中扮演着重要角色，研究表明，A2A受体激动剂CGS 21680 HCl通过NF-κB-KRT16通路抑制M1型巨噬细胞的活化，从而减少CXCL10/11的分泌并抑制Th1/17细胞的分化，从而减轻咪喹莫特和鼠IL-23蛋白诱导的银屑病炎症[19]。上述核心靶点分析表明，苦茶碱可能主要通过降低CTSS表达、阻止FLG表达、抑制T细胞活化、促进细胞焦亡从而在特应性皮炎中发挥作用。

GO基因富集分析表明，苦茶碱主要通过G蛋白偶联的腺苷酸和嘌呤能受体、膜蛋白胞外域蛋白水解、膜蛋白蛋白水解、β淀粉样蛋白形成和代谢过程、淀粉样前体蛋白分解代谢过程、嘌呤能核苷酸受体信号传导通路等生物过程来发挥作用。KEGG信号通路结果显示，苦茶碱调节特应性皮炎的通路主要集中Notch信号通路、神经活性配体信号传导通路、类固醇激素生物合成通路FcℇRI信号通路等。

综上所述，本研究基于网络药理学探讨了苦茶碱治疗特应性皮炎的潜在作用机制，主要通过调节CTSS、SYK、BACE1、HDAC1、ADORA2A等基因靶点，通过Notch信号通路、神经活性配体信号传导通路、类固醇激素生物合成通路、FcℇRI信号通路等发挥治疗特应性皮炎的作用。本研究结果为进一步探索苦茶碱治疗特应性皮炎的作用机制提供了理论基础。然而，网络药理学的分析仍存在一些局限性，需进一步通过细胞以及动物实验来证实其作用机制和效果。

NOTES

^*通讯作者。