基于叶绿体全基因组序列中的物种特有变异位点的木樨科植物资源遗传多样性的分子鉴定新方法

A Novel Molecular Identification Method for Assessing Genetic Diversity of Oleaceae Plant Resources Based on Taxon-Specific Variable Nucleotide Sites in Chloroplast Genome Sequences

摘要: 准确鉴定植物的遗传多样性是资源保护与可持续利用的基础。木樨科植物具有极高的食用、药用、观赏价值，同时在经济与生态保护方面也发挥着重要作用。由于植物的表型特征会受到发育阶段和环境条件的影响，不同学者对表型特征的理解和判断存在差异，导致基于表型特征的木樨科植物鉴定存在困难。本研究利用木樨科17个样品的叶绿体全基因组序列，从中筛选出物种特有的1114个核苷酸变异位点作为分子性状，并以此编制分子鉴定检索表，成功鉴定了供试样品。研究发现，物种特有的变异位点数量以及核苷酸构成，在属/种/亚种之间存在明显差异。结果显示，叶绿体全基因组DNA序列中的单核苷酸变异位点信息，能够用于木樨科植物资源遗传多样性的分子鉴定。本研究对于推动木樨科植物的分类修订、资源保护和利用具有重要意义。

Abstract: Accurate identification of plant genetic diversity is the foundation for resource conservation and sustainable utilization. Oleaceae plants possess extremely high edible, medicinal, and ornamental values, while also playing significant roles in economic and ecological protection. As plant phenotypic traits are influenced by developmental stages and environmental conditions, differences in understanding and judgment among scholars regarding these traits lead to challenges in identifying Oleaceae plants based on phenotypic characteristics. This study utilized the chloroplast genome sequences of 17 Oleaceae samples to screen 1114 taxon-specific nucleotide variation sites as molecular characters, based on which a molecular identification key was developed, successfully identifying the tested samples. The study found that both the number of taxon-specific variation sites and nucleotide composition exhibited significant differences among genera, species, and subspecies. The results showed that single nucleotide variation site information in chloroplast whole-genome DNA sequences can be used for molecular identification of genetic diversity in Oleaceae plant resources. This study holds significant importance for advancing taxonomic revision, resource conservation, and utilization of Oleaceae plants.

1. 引言

木樨科Oleaceae是真双子叶植物，隶属于唇形目，在全球分布广泛，涵盖温带至亚热带地区，全球约有29个属，包含约400种植物。木樨科植物具有多方面的价值，包括食用、观赏、药用、木材利用以及环境保护[1]-[3]。例如，桂花Osmanthus fragrans多蜜，含有β-紫罗兰酮、萜品醇、乙酸-3-己烯酯、罗勒烯以及芳樟醇等多种芳香化合物。这些成分赋予了桂花浓郁而持久的独特香味。桂花的香料提取物可用于制作桂花糕、桂花元宵等传统食品，增添独特的桂花香气，改善或增强食品的香味；桂花的香料提取物也广泛用于化妆品中，如香水、护肤品等，还可用于制作空气清新剂、香薰蜡烛等日化产品[1] [2] [4] [5]。茉莉花Jasminum sambac是提升品质的天然素材，通过花香吸附工艺，将茉莉花与绿茶窨制，可制成中国十大名茶之一的茉莉花茶，其香气浓郁持久，茶汤黄绿明亮，具有提神醒脑、消食解腻的功效。茉莉花可制成花酱、香包、扩香石、护肤品等。桂花和茉莉花都是著名的观赏植物，它们的香料资源在食品、日化、医药等多个领域展现出显著的经济效益[1] [2] [6]。茉莉花象征着忠贞、清纯和友谊。在文学、音乐、绘画等领域，茉莉花都有广泛的体现，歌曲《茉莉花》闻名世界。木樨榄(木犀榄、油橄榄) Olea europaea的果实经过压榨可以得到橄榄油，其油脂成分天然且稳定，不需要复杂的加工就可以直接食用，营养价值高，而且容易被人体吸收，被誉为“植物油皇后”和“地中海甘露”[1] [2] [7]。

木樨科植物的叶、根、花、果实等都是重要的中药材[1] [2] [8]。例如，连翘Forsythia suspensa的果实是中成药银翘解毒丸的主要成分之一，具有清热解毒的功效[1] [2] [8]。油橄榄的药用历史非常悠久，地中海地区的民间医疗利用油橄榄叶治疗发烧以及疟疾等多种疾病[1] [2] [7] [8]。木樨科植物广泛用于城乡景观绿化和环境修复[1] [2]。例如，丁香具有抗旱、耐寒、耐盐碱的特性。丁香的花很繁盛，香气芬芳[1] [2]。女贞Ligustrum lucidum能够抗二氧化硫、氯气，具有净化空气的作用；女贞的果实是鸟类的食物，对于维持生物多样性具有生态价值[1] [2]。木樨科有些植物种类的木材质量优良[1] [2]。例如，白蜡树Fraxinus chinensis的木材可以用来制作家具、工具柄、枕木等[1] [2]。油橄榄的木材坚硬，纹理细致，是制作器具和手工艺品的优良材料[1] [2] [7]。

木樨科植物经历了多次多倍体化事件，例如，约5300万年前至6100万年前期间发生了六倍体化事件，约1800万年前至2100万年前期间发生了四倍体化事件。这些事件为物种的多样化提供了遗传基础[9]。通过对木樨科的298个物种的代表样品进行系统发育树的重建，发现木樨科的起源时间可以追溯到约8600万年前，亚洲的热带地区是木樨科物种扩散的主要来源地[10]。

木樨科植物的分类采用的表型性状包括：叶的着生方式(例如，对生方式)、叶形(例如，单叶、三出复叶或者羽状复叶等)、叶边缘特征(例如，叶缘是全缘还是具齿)、叶柄、托叶、花的特征(例如，花的颜色、辐射对称性、花冠裂片数、雄蕊数目、花序类型等)、果实的特征(例如，是核果、蒴果、浆果、翅果，还是浆果状核果，不同属的果实形态差异比较显著)、子房结构以及花期等。由于表型特征在种/亚种/属之间存在一定的相似性，而且性状的表现会受到植物生长发育阶段、季节或者环境条件的影响，仅依据表型特征来鉴定木樨科植物资源的多样性存在难度[1] [2] [11]-[14]。

木樨科植物的分类研究经历了多种方法的探索，包括形态学、细胞学、孢粉学、化学成分、RAPD、AFLP、ISSR、SSR标记、DNA条形码技术等[1] [2] [11]-[19]。引入新技术、增加信息量、提高物种分辨力仍然是研究的重要方向[20]-[37]。近年来，叶绿体全基因组序列数据已经广泛应用于植物的物种鉴定和系统发生学研究，这种数据信息量大，能够提升物种的分辨率[20]-[37]。为了促进木樨科植物资源的保护、可持续利用以及相关产业的发展，本文报道一种在分子水平上鉴定木樨科植物资源遗传多样性的新方法。

2. 材料与方法

17份样品代表木樨科的4个物种，每个物种重复取样3~7个植株。供试样品名称及其叶绿体全基因组的序列号如表1 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)。根据本团队研发的方法[27]-[37]编制分子鉴定检索表。利用MAFFT v7.055b软件[38]获得比对序列矩阵。比对后的序列矩阵的长度为157,737个核苷酸，由左向右，左端(5’-端)起的第1个核苷酸字母的位置编号为1，最右端的核苷酸字母的位置编号为157,737。用MEGA 7.0 [39]和DnaSP v6软件[40]检测核苷酸变异位点(图1，表2)。每个物种的特有核苷酸变异位点作为分子性状，用于编写供试样品的分子鉴定检索表(见图1)。利用马鞭草科Verbenaceae海榄雌属Avicennia L.的海榄雌Avicennia marina (Forssk.) Vierh.以及胡麻科Pedaliaceae芝麻属Sesamum L.的芝麻Sesamum indicum L.作为外类群(表1和图1)。用MEGA 7.0软件的Tamura 3-parameter model参数模型推断系统发生关系(图2)。分子鉴定检索表(图1)的运算基于每个物种的全部供试样品的基因组序列数据(表1)。为节约篇幅，图2中，每个物种仅展示3个代表样品。

Table 1. Samples and GenBank accession numbers for the chloroplast genome sequences used in this study

表1. 供试样品及叶绿体基因组序列号

	拉丁学名 Latin name	中文名称 Chinese name	序列号 GenBank accession No.
1	Abeliophyllum distichum Nakai	翅果连翘	MK616470.1, MN116559.1, MN127986.1
2	Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl	连翘	PV567297.1 (isolate ENC868427), PV567298.1 (isolate ENC868428), PV567302.1 (isolate ENC870086), PV567303.1 (isolate ENC870087), PV567304.1 (isolate ENC870088), PV567305.1 (isolate ENC870089), MF579702.1
3	Olea europaea subsp. cuspidata (Wall. & G. Don) Cif.	锈鳞木樨榄	MT560021.1 (voucher Hengduan team 1114), MT560022.1 (voucher BOP215910), MT560023.1 (voucher Tibetan team 13384), MT560024.1 (voucher Tibetan team 12907)
4	Tetrapilus caudatilimbus (L.C. Chia) de Juana	尾叶滨木樨榄	MT560027.1 (voucher BOP215905), MT560029.1 (voucher Cunyu Yang et al 4670), MT560030.1 (voucher POC544614)
5	^*Avicennia marina (Forssk.) Vierh.	海榄雌	MN307164.1
6	^*Sesamum indicum L.	芝麻	KC569603.1

注：Olea caudatilimba L.C. Chia是尾叶滨木樨榄Tetrapilus caudatilimbus的异名。^*外类群。

Figure 1. Molecular identification key for four taxa in the Oleaceae based on taxon-specific nucleotide variant sites within chloroplast genome sequences

图1. 基于叶绿体全基因组序列中的物种特有核苷酸变异位点的木樨科4个物种的分子鉴定检索表

Table 2. Base composition of variable nucleotide sites for identification of four taxa in the Oleaceae

表2. 木樨科4种植物的具有分类价值的核苷酸变异位点数目及碱基构成

^*	A (%)^**	T (%)^**	C (%)^**	G (%)^**	Total^*** 合计(%)
1a	50 (25.77)	68 (35.05)	34 (17.53)	42 (21.65)	194 (17.41/)
1b	36 (18.56)	41 (21.13)	67 (34.54)	50 (25.77)	194 (17.41/)
2a	71 (27.00)	82 (31.18)	39 (14.83)	71 (27.00)	263 (23.61/)
2b	59 (22.43)	63 (23.95)	75 (28.52)	66 (25.10)	263 (23.61/)
3a	72 (23.30)	84 (27.18)	76 (24.60)	77 (24.92)	309 (27.74/)
3b	80 (25.89)	82 (26.54)	68 (22.01)	79 (25.57)	309 (27.74/)
4a	80 (22.99)	92 (26.44)	81 (23.28)	95 (27.30)	348 (31.24)
4b	79 (22.70)	98 (28.16)	88 (25.29)	83 (23.85)	348 (31.24)
合计					1114/2584

注：^*该列的序号与检索表内的序号对应；1a为连翘Forsythia suspensa，2a为翅果连翘Abeliophyllum distichum，3a为尾叶滨木樨榄Tetrapilus caudatilimbus，4a为锈鳞木樨榄Olea europaea subsp. cuspidata。^** 核苷酸变异位点数(在4种碱基中的占比)；^***此列括号中，前一个数字是在物种特有变异位点总数(1114)中所占的比例；后一个数字是在全部核苷酸变异位点总数(2584)中所占的比例。

Figure 2. Phylogenetic relationships among four taxa in the Oleaceae based on the chloroplast whole-genome sequences using the neighbour-joining method with the Tamura 3-parameter model. The numbers near the branches are bootstrap support values (%) of 1000 replications

图2. 基于叶绿体全基因组序列的木樨科4个物种的系统发生关系。分支图中的数字为1000次重复抽样的自展支持率

3. 结果

木樨科供试样品的叶绿体基因组序列的全长为155,530 bp (如，MT560022.1, Olea europaea subsp. cuspidata)~156,405 bp (如，PV567303.1, Forsythia suspensa, PV567304.1, Forsythia suspensa, PV567298.1, Forsythia suspensa)。在比对序列中，共检测到2584个核苷酸变异位点，占叶绿体基因组序列全长的约1.66%。其中，物种的特有核苷酸变异位点数目合计为1114个，占变异位点总数的43.11%。锈鳞木樨榄Olea europaea subsp. cuspidata (348)的特有变异位点的数量最多，其次是尾叶滨木樨榄Tetrapilus caudatilimbus (309)、翅果连翘Abeliophyllum distichum (263)、连翘Forsythia suspensa (194)。锈鳞木樨榄的特有变异位点中，G (27.30%)和T (26.44%)的比例大于C (23.28%)和A (22.99%)。尾叶滨木樨榄的特有变异位点中，T (27.18%)的比例高于其它3类核苷酸。翅果连翘的特有变异位点中，T的比例(31.18%)是C的比例(14.83%)的2.1倍；G (27.00%)和A (27.00%)的比例是C的比例的1.8倍，T、A和G的比例之间差异较小。连翘的特有变异位点中，T的比例(35.05%)是C的比例(17.53%)的约2.0倍，是G的比例(21.65%)的1.6倍，是A的比例(25.77%)的1.3倍以上(表2)。物种的特有变异位点的数量和核苷酸构成存在属/种/亚种间差异。利用物种的特有核苷酸变异位点，编制分子鉴定检索表，供试样品得到精准鉴定(图1和图2)。

4. 讨论

对21国40个植物标本馆的4500份标本的取样调查结果显示，50%以上的热带植物标本存在名称鉴定错误[41]。我们对中国标本馆系统120多年来采集、保存的木樨科植物标本的调查结果显示，中国馆藏的木樨科植物标本总计74,484份。利用TNRS网站(https://tnrs.biendata.org/)查证植物标本的正确名称和异名的结果显示，其中，异名数量(480)占出现名称总数(826)的约58.11%。仅有属名、没有种名的标本数量占标本总数的2.10%。此外，虽然标注为木樨科植物的物种名称，但名称无法查证的标本占号称木樨科植物标本总数74,944份的0.61% [42]。植物分类学中，正确名称是指根据《国际藻类、菌物和植物命名法规》(International Code of Nomenclature for algae, fungi, and plants (Madrid Code)，简称ICN)确认的、当前有效的物种学名。异名(Synonym)是指与正确名称指代同一植物，但未被采用的学名[43]。利用TNRS网站的查证结果显示，李榄属Linociera Sw. ex Schreb.是流苏树属Chionanthus Royenden的异名[44]，然而，实际情况要比表面上看起来的复杂，包含在李榄属内的745份标本是4个属(滨木樨榄属Tetrapilus Lour.、木樨榄属Olea L.、冠花榄属Noronhia Stadman ex Thouars以及流苏树属)的植物的混合体。基于现有的植物标本记录，结合DNA分析等多种技术的研究成果，需要构建高质量的植物标本信息库[42] [45] [46]。扩大成功精准鉴定的物种数量规模，才能有助于深度信息的挖掘。本研究对于推动木樨科植物的分类修订、资源保护和利用具有重要意义。

地球植物多样性的准确鉴定，对于控制全球气候变暖具有重要作用[47]。叶绿体基因组DNA序列的结构与功能之间的关系对于理解和利用光合作用至关重要。例如，德国Ralph Bock教授团队利用实验方法探索了叶绿体基因组中反向重复区(a large inverted repeat (IR) region)的功能重要性[48]。全基因模型认为，复杂性状受到与性状直接相关的特定基因/基因通路的影响，这些基因的数量很少，称为核心基因。核心基因一旦失去功能，会对表型产生巨大影响。核心基因会受到其它基因的调控，调控核心基因的基因称为外围基因。基因之间的调控具有网络特征[49]。叶绿体是半自主细胞器，叶绿体基因组与细胞核基因组以及线粒体基因组之间存在较为复杂的信息交流[50]。深度理解叶绿体基因组DNA序列的结构，是重要研究方向之一。

感 谢

研究期间，得到国家植物标本资源库、华中农业大学、西北民族大学、鲁东大学、中国环境科学学会、乌兰察布市农林科学研究所、东北石油大学、中国图象图形学学会、大连理工大学、大连海洋大学、CSIG竞赛与培训工作委员会、中国三峡新能源(集团)股份有限公司、海南医科大学、北京文化产业投融资协会、国家纳米科学中心、北方工业大学、中科院理化技术研究所的大力支持。本研究得到石硕、刘艳磊、梁露花、方均宣、常青、张华崇、戎素平、田宏、王芸等多位老师的热情支持。

基金项目

国家自然科学基金项目(No. 31770744)。

NOTES

^*通讯作者。