基于UPLC-MS/MS技术及生物信息学探究藤三七抗胃溃疡的物质基础及作用机制

Exploring the Material Basis and Mechanism of Anredera cordifolia (Ten.) Sreenis against Gastric Ulcer Based on UPLC-MS/MS and Bioinformatics

摘要: 目的：明确藤三七抗胃溃疡(GU)的药效物质及其作用机制。方法：UPLC-Q-TOF-MS鉴定藤三七水提液成分，在TCMSP、GeneCards筛选活性成分与疾病靶点，Venny取交集后构建PPI网络，Cytoscape拓扑分析获取核心靶点。DAVID进行GO与KEGG富集。结果：共鉴定出藤三七成分160种，其中40个符合OB > 30%、DL > 0.18，映射239个GU相关靶点。TNF、IL-6、AKT1、TP53、IL-1β为度值前五位核心靶点；IL-17与TNF信号通路富集最显著。结论：藤三七通过多成分协同调控IL-17/TNF通路，抑制炎症与氧化应激发挥抗胃溃疡作用。

Abstract: Objective: To identify the bioactive constituents and potential mechanisms of Anredera cordifolia (Ten.) Sreenis in the treatment of gastric ulcer (GU). Methods: Components of the aqueous extract of Anredera cordifolia (Ten.) Sreenis were characterized by UPLC-Q-TOF-MS. Putative active ingredients and GU-related targets were retrieved from TCMSP and GeneCards, respectively. Intersection targets were imported into a Protein-Protein Interaction (PPI) network constructed in Cytoscape. Topological analysis was applied to screen core targets. GO and KEGG enrichment analyses were performed with DAVID. Results: A total of 160 constituents were identified, 40 of which met the criteria of Oral Bioavailability (OB) > 30% and Drug-Likeness (DL) > 0.18. These compounds mapped to 239 GU-associated targets. The top five hub genes ranked by degree were TNF, IL-6, AKT1, TP53 and IL-1β. The IL-17 and TNF signaling pathways were the most significantly enriched. Conclusion: Anredera cordifolia (Ten.) Sreenis exerts anti-gastric-ulcer effects through multi-component synergy that modulates the IL-17/TNF pathway, thereby suppressing inflammation and oxidative stress.

1. 引言

胃溃疡是上消化道最常见的疾病，其发病机制主要包括胃酸分泌过多、幽门螺杆菌感染等因素。胃溃疡在西方人群中的患病率为2.4%，年发病率为0.10%至0.19%。在中国大陆武汉等地区，胃溃疡的患病率在一般人群中高达6.07%，22.5%的有胃肠道症状的患者有胃溃疡[1]。吸烟、使用NSAID或饮酒的人群通常发病率较高，复发率高达60%。尽管目前临床上有一些H2受体拮抗剂、质子泵抑制剂、组胺受体抑制剂和抗酸剂可以改善胃溃疡的发生发展[2]-[4]，然而这些药物在GU的治疗效果有限，并且长期使用药物可能引起胃黏膜结构和功能的变化，如造成胃底腺息肉的形成、肠嗜铬样细胞增生和高胃泌素血症等副作用，这大大限制了临床应用[5]。

藤三七(Anredera cordifolia (Ten.) Sreenis)是落葵科(Basellaceae)落葵薯属(Anredera Juss.)多年生蔓生植物，别名洋落葵，又称落葵薯、川七、藤子三七、土三七等[6]，属药食同源植物，具有活血化瘀、消肿止痛等多种功效。现代研究表明，藤三七具有抗胃溃疡、促进皮肤伤口愈合和抗炎等药理作用。藤三七能通过减少转化生长因子-β1活性，促进小鼠皮肤伤口的愈合[7]。此外，藤三七和鳄梨的混合提取物能显著减少脂多糖刺激引起的巨噬IL-1、TNF-α和IL-6释放的增多，抑制炎症的发生和发展[8]。前期的研究证实，藤三七能改善无水乙醇诱导的小鼠急性胃溃疡的面积，提示藤三七可能具有抗急性GU的潜力。然而，有关藤三七抗GU的药效物质基础和作用机制目前尚不明确。

基于此，本项目采用UPLC-Q-TOF-MS鉴定出藤三七药材成分。采用网络药理学对藤三七的成分进行分析，构建藤三七药物–靶点–疾病网络，结合分子对接对网络药理学的预测结果进行进一步预测，其结果旨在深入解析藤三七抗GU的药效物质基础及作用机制。

2. 实验方法

2.1. 仪器与试剂

2.1.1. 实验仪器与设备

超高效液相色谱串联傅里叶变换质谱UHPLC-QExactive，美国赛默飞公司；HSST3色谱柱(100 mm × 2.1 mmi.d., 1.7 µm)，美国Waters公司；JXDC-20型氮气吹扫仪，上海净信实业发展有限公司；LNG-T88型台式快速离心浓缩干燥器，太仓市华美生化仪器厂；Wonbio-96c型高通量组织破碎仪，上海万柏生物科技有限公司；SBL-10DT型控温超声波清洗机-10L，宁波新芝生物科技股份有限公司；Centrifuge 5424 R和Centrifuge5430R型冷冻离心机，德国Eppendorf公司；NewClassic MS电子天平，METTLER TOLEDO公司。

2.1.2. 试剂

色谱纯甲醇(Fisher公司)，色谱纯乙腈(Fisher公司)，色谱纯甲酸(Fisher公司)，色谱纯水(Fisher公司)，色谱纯丙醇(Fisher公司)。

2.2. 藤三七药材原型成分分析

精确称取藤三七药材1 g，加入20 mL纯净水，超声提取30 min，8000 g离心5 min，提取上清液1 mL用0.22 um尼龙微孔滤膜过滤，将滤液放至1.5 mL进样小瓶中，上机待测。

2.3. 检测条件

C18柱色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18 (100 mm × 2.1 mm, 1.7 µm; Waters, Milford, USA)；流动相A为2%乙腈水(含0.1%甲酸)，流动相B为乙腈(含0.1%甲酸)，进样量为3 μL，柱温为40℃。质谱条件：样品经电喷雾电离，分别采用正、负离子扫描模式采集质谱信号。具体参数见下表：质量扫描范围m/z：70~1050。离子喷雾电压，正离子电压3500V，负离子电压−3000V，鞘气流速50 arb，辅助加热气13 arb，离子源加热温度450℃，毛细管温度320℃，20~40~60V循环碰撞能。

2.4. 网络药理学研究

2.4.1. 化学成分的建立

通过TCMSP数据库，检索“槐花”所有的化学成分，以OB > 30、DL > 0.18为筛选条件，此条件下默认为该化合物为活性成分，筛选出藤三七的活性成分及作用靶点，并通过UniProt数据库将靶点的蛋白名转化成基因名格式，最终建立成分靶点数据集。

2.4.2. 胃溃疡靶点基因预测

通过GeneCards (https://www.Genecards.org/)数据库，检索关键词“Gastric ulcer”，整合结果并剔除重复基因，获得胃溃疡的靶点基因信息。分析藤三七和胃溃疡的靶点基因，利用韦恩图来展示药物和疾病之间共有的靶点基因。使用Cytoscape 3.8.2软件，以药物、成分和靶点作为节点，它们之间的相互作用关系作为边，构建药物、成分和靶点之间的作用网络。

2.4.3. 蛋白质互作(PPI)网络构建

在String数据库(https://string-db.org/)对交集靶点进行分析，选择“Homo sapiens”物种，设定置信度阈值为0.7。将结果导入Cytoscape 3.8.2进行拓扑分析，计算度值(Degree)并以节点大小和颜色反映，获得PPI网络图。

2.4.4. 基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书( KEGG)富集分析

利用DAVID数据库(https://davidbioinformatics.nih.gov/)对所获得的加味四妙散和痛风性关节炎的交集靶点进行GO和KEGG富集分析，预测此方治疗GA的作用机制，结果以气泡图和柱状图展示。

3. 结果

3.1. 藤三七的测定结果

该研究采用UPLC-Q-TOF-MS联用技术对藤三七提取物进行系统分析，通过与对照品、分子离子峰精确质量数、二级谱图等信息比对，并结合文献和化合物数据库，获得正、负离子模式下的藤三七样品正离子流图和负离子流图(图1，图2)。通过高分辨质谱结合多元数据分析方法，成功鉴定出160种化学成分，其中在正离子模式下鉴定出127个化学成分，在负离子模式下鉴定出33个化学成分，在这些化学成分中，萜类成分有47个，黄酮类成分有29个，酚酸类及其衍生物9个、香豆素类及其衍生物7个，其他化合物37个。

Figure 1. Positive ion mode mass spectrum of Anredera cordifolia (Ten.) Sreenis

图1. 藤三七正离子模式图谱

Figure 2. Negative ion mode chromatogram of Anredera cordifolia (Ten.) Sreenis

图2. 藤三七负离子模式图谱

3.2. 藤三七化合物及靶点筛选结果

通过UPLC-MS/MS数据库，以OB > 30、DL > 0.18为筛选条件，共得到藤三七化学成分40个，分别为：Trigonelline、Scoparone、Oxyberberine、(+)-Syringaresinol、aloe-emodin、britannilactone及(+)-Zeylenol等，潜在靶点762个，删除共有靶点277个，具体见表1。

Table 1. Information of compounds and targets

表1. 化合物及靶点信息

化合物	OB	DL	靶点数目
Trigonelline	60.07	0.03	5
Scoparone	74.75	0.09	19
Oxyberberine	36.68	0.82	20
(+)-Syringaresinol	3.29	0.72	8
aloe-emodin	83.38	0.24	24
britannilactone	61.23	0.14	5
(+)-Zeylenol	79.58	0.45	1
meranzin hydrate	43.61	0.17	8
resveratrol	19.07	0.11	151
Moracin D	60.93	0.38	14
Tangeretin	21.38	0.43	29
Glabridin	53.25	0.47	25
Epibetulinic acid	15.66	0.78	6
Kirenol	23.18	0.39	3
Hecogenin	15.86	0.79	2
Ursolic acid	16.77	0.75	55
Oleanolic acid	29.02	0.76	6
Rheochrysidin	22.29	0.27	16
Berlambine	36.68	0.82	10
Nobiletin	61.67	0.52	35
Norwogonin	39.4	0.21	12
Linderalactone	69.58	0.17	8
3',4',5,7-Tetramethoxyflavone	43.68	0.37	32
Glycyrrhetinic acid	22.05	0.74	6
Echinatin	66.58	0.17	18
Alloimperatorin	36.31	0.22	15
Tetrahydrocoptisine	48.25	0.85	17
Atractylenolide i	37.37	0.15	8
Atractylenolide ii	47.5	0.15	5
Farrerol	42.65	0.26	7
Lathyrol	50.76	0.34	1
5,7-dihydroxyflavanone	64.72	0.18	13
Licocoumarone	33.21	0.36	7
hederagenin	36.91	0.75	22
Tectorigenin	28.41	0.27	29
Puerarin	24.03	0.69	55
isoliquiritigenin	85.32	0.15	30
Melilotoside	36.85	0.26	3
Oroxylin A	41.37	0.23	26
Pisatin	88.05	0.64	6

3.3. 藤三七分子靶点网络分析

在GeneCards数据库中以“Gastric ulcer”为关键词，检索出与胃溃疡相关靶基因共6840个，采用Venny2.1对藤三七相关靶点及胃溃疡靶点进行维恩图绘制，见图3，得到共有靶点239个，这些靶点包括CTNNA1、TP53、IL1B、TNF、IL6和BRCA2等。

Figure 3. Intersection of Anredera cordifolia (Ten.) Sreenis active ingredient target and GU target points

图3. 藤三七活性成分靶点与GU交集靶点

3.4. 核心靶点的预测

基于String数据库得到的靶点间相互作用网络、基于Cytoscape3.9.1得到的靶点间相互作用网络见图4。选取度值最高的10个靶点作为藤三七片抗胃溃疡的关键靶点：肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor, TNF)、白介素6 (Interleukin 6, IL-6)、AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1 (AKT serine/threonine kinase 1, AKT1)、肿瘤蛋白53 (Tumor protein 53, TP53)和白细胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)，颜色深的节点度值越高。

Figure 4. Protein interaction network diagram

图4. 蛋白互作网络图

3.5. GO富集分析结果

GO富集分析结果如图5所示，GO富集分析得到55个条目，包括25个生物过程(Biological process, BP)、14个分子功能(Molecular Function, MF)和16个细胞成分(Cellular Component, CC)。条目的高度与富集程度成正比，结果表明，富集程度最高的为BP，主要为单体过程和细胞过程，其次在MF中，连接富集程度也较高，提示银花泌炎灵片中核心靶点可能主要通过上述BP发挥其抗急性肾盂肾炎作用。

Figure 5. Bar chart of GO enrichment analysis

图5. GO富集分析条形图

3.6. KEGG富集分析结果

KEGG信号通路分析，结果如图6所示，将交集靶点导入Metascape 数据库共获得161条相关信号通路，根据P值排序，得到前20条信号通路，导入Omicshare云平台生成高级气泡图。靶点数目越多则气泡越大，同时气泡颜色表示P值的大小。结合文献，将20条通路进一步筛选得到2条关键通路：白细胞介素-17 (Interleukin 17, IL-17)信号通路和TNF信号通路。

Figure 6. Bubble chart of KEGG enrichment analysis

图6. KEGG富集分析气泡图

4. 讨论

藤三七目前被作为药食两用的药材，具有治疗胃溃疡的药理作用，但其作用机制尚不明确。已有研究表明，藤三七中的萜类成分、如resveratrol、Oleanonic acid和Glycyrrhetinic acid等具有改善胃溃疡的作用。问慧娟等人研究表明，白藜芦醇能明显降低水浸–束缚应激大鼠的胃溃疡指数，显著提高胃黏膜血流量，降低胃黏膜组织iNOS活性和MDA水平，提高SOD活性，其机制可能与增加胃黏膜血流量，抗氧化和抑制iNOS有关[9]。李雅玲在综述阐述到，齐墩果酸对醋酸引起的胃溃疡有治疗作用。齐墩果酸给药剂量从50mg/kg增长到100mg/kg时，胃损伤治疗比率从54.5%增加到76%，使得胃受损区明显减少，胃溃疡被修复[10]。甘草酸50mg/kg灌胃仅对大鼠盐酸乙醇溃疡有抑制作用。Mody Albalawi (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=Albalawi+M&cauthor_id=40867886 )研究表明，甘草酸(GLY)是一种天然抗炎剂，具有良好的胃保护特性，GLY纳米颗粒(GLY-NP)可以治疗由乙醇诱导的GU，提高SOD水平、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性，同时降低MDA水平，显着改善抗氧化防御，超过了OMP的作用。此外，GLY-NPs通过下调p38 MAPK、NF-κB和TNF-α表达来调节炎症反应，同时上调抗炎细胞因子IL-10。GLY-NP通过综合调节氧化应激、炎症和分子信号通路，具有更高的胃保护作用。这项研究强调GLY-NP是有效管理GU的有效纳米替代药物[11]。葛根素可以明显减轻浸水应激引起的胃黏膜损伤，抑制胃运动亢进，尤其是降低胃运动指数、收缩时间百分比和高强度收缩次数，增加胃黏膜血流量，同时增加胃黏膜NO含量，并降低ET含量;胃黏膜组织损害程度显著减轻[12]。这些研究表明，藤三七在治疗GU具有多成分，多层次的特点。

PPI研究表明，藤三七在治疗GU的核心靶点是TNF、TP53、IL6、IL1B、AKT1。TNF-α和IL-1β是胃溃疡发病中的关键炎症因子。研究发现，幽门螺杆菌(H. pylori)感染会诱导胃黏膜产生TNF-α和IL-1β，这些细胞因子通过促进炎症反应和黏膜损伤，参与胃溃疡的发生和发展[13] [14]。在临床研究中，胃溃疡患者(PUD组)的TNF-α和IL-1β水平显著高于非溃疡对照组(NPUD组)，表明这两种细胞因子与胃溃疡的病理过程密切相关[13]。IL6是另一个重要的炎症因子，其表达水平在胃溃疡患者中显著升高。IL6通过激活炎症信号通路(如IL-17和TNF信号通路)促进胃黏膜炎症和溃疡形成[15] [16]。IL1B是胃溃疡中另一个关键的炎症因子，其表达水平在H. pylori感染的患者中显著升高。IL1B通过激活NF-κB信号通路促进胃黏膜炎症和溃疡形成[17]。

Kegg富集分析中前10的信号通路中，IL-17 signaling pathway、TNF signaling pathway等炎症通路参与了胃溃疡的调控，IL-17 signaling pathway中的白细胞介素17 (IL-17)是一种促炎细胞因子，对于哺乳动物抵御细菌和真菌病原体的免疫防御至关重要。研究表明，IL-17信号通路在胃损伤过程中非常重要，值得一提的是IL-17与NETs形成之间的紧密联系，IL-17增加中性粒细胞浸润，被认为是NETs形成的有效启动子。IL-17信号通路与NET形成在吲哚美辛诱导的胃损伤中的潜在联系已被证实[18]。IL-17信号通路主要通过Th17细胞分泌的细胞因子(如IL-17A、IL-17C)激活，诱导炎症反应和组织损伤，在胃溃疡中表现为过度表达和与疾病严重性的正相关[19]。TNF signaling pathway中的肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor, TNF)是一种重要的细胞因子，可诱导多种细胞内信号通路，包括细胞凋亡和细胞存活，以及炎症和免疫。活化的TNF被组装成一个同源三聚体，并与其受体(TNFR1, TNFR2)结合，导致TNFR1或TNFR2的三聚化。TNFR1几乎在所有细胞中表达，是TNF(也称为TNF-α)的主要受体。TNF-α是胃溃疡中的核心促炎因子，其水平在H. pylori感染的胃溃疡患者中显著升高。TNF-α通过激活NF-κB和MAPK通路，促进IL-1β、IL-6等炎症因子的释放，导致胃黏膜炎症和损伤[13] [20]。现有研究表明，甘草次酸、熊果酸、齐墩果酸、白藜芦醇、川陈皮素、橘皮素、葛根素和异甘草素最可能通过调控IL-17/TNF-α相关通路发挥抗胃溃疡作用[21]-[25]。

总之，通过藤三七抗GU的网络药理学研究，初步明确藤三七抗胃溃疡活性成分、关键靶点，生物过程及作用机制，可为下一步的实验验证提供参考。

基金项目

广东江门中医药职业学院科学研究项目课题(〔科〕JMZYYKY20232008)；江门市科技局(江科〔2024〕99号，项目编号：2024YL05007)；青年创新人才项目(自然科学) (项目编号：2024KQNCX305)。

NOTES

^*通讯作者。