1. 引言
解郁养心合剂是我院国家级名中医应用多年的经典验方，选用柴胡、当归、白芍等18味中药组成复方制剂，具有疏肝解郁、养心安神之功效。临床常用于治疗肝气郁结型郁病，包括抑郁症、焦虑症、失眠症等，效果显著。古代抗抑郁方剂用药呈“疏肝为主，健脾为辅，兼养血”三角结构；现代中药方剂继承创新，以疏肝、健脾等药联合组方，强化“活血通络、化痰开窍、清热除烦”配伍[1]。柴胡–白芍是临床治疗郁证最常用的药对之一。现代研究发现，柴胡中的柴胡皂苷、黄芩苷、槲皮素、山柰酚等活性成分可以作为治疗神经系统疾病的主要物质基础[2]，其通过调控多种信号通路和调节肠道菌群结构发挥抗抑郁的作用[3]。柴胡皂苷a、d是柴胡主要的皂苷类化合物及活性成分，《中华人民共和国药典》2025年版[4]也以其含量作为质量控制的主要指标。白芍药理作用包括抗炎、抗抑郁、镇痛、保肝等。卜俊文等[5]对白芍质量标志物进行预测分析，认为白芍中的单萜及其苷类、黄酮类、鞣质类、挥发油类成分可视为衡量其质量优劣的核心指标。芍药苷作为其特征性化学成分，常用来定性识别。当归是传统的补气活血良药，现代研究表明，当归所含的多糖、有机酸和挥发油等化学成分具有抗炎、心脑血管保护、神经保护、免疫调节、降血糖、抗肿瘤等生物活性[6]。近年来，其抗抑郁药理作用及机制受到越来越多的关注。李硕等[7]基于网络药理学探讨当归药理作用机制，发现其抗抑郁作用可能是通过促进儿茶酚胺释放，增加神经递质水平以及抑制钙离子内流等途径实现。宋亚鹏[8]研究发现，当归抗抑郁作用与干预中枢系统鞘脂代谢ASM/Cer通路发挥神经保护作用，及抑制NLRP3炎症小体通路的激活降低神经炎症有关。为了更好地控制解郁养心合剂的质量，确保临床用药安全有效，促进制剂开发应用，对其质量标准进行了研究，使用薄层色谱法鉴别其中的当归和白芍药材，利用高效液相色谱法测定其中的柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量。
2. 仪器与试药
2.1. 仪器
岛津LC-2030型高效液相色谱仪(紫外检测器)、Good See-20E薄层色谱成像系统、KQ5200DE型数控超声波清洗器、RE-2000A型旋转蒸发器。
2.2. 试药
解郁养心合剂(十堰市中医医院制剂室，批号20250811、20250915、20251027)，当归对照药材(批号：120927-201516)、芍药苷对照品(批号：110736-202246)、柴胡皂苷a对照品(批号：110777-201910)、柴胡皂苷d对照品(批号：110778-201912)均购自中国药品生物制品检定所，乙腈(色谱纯)，甲醇、乙醇、乙醚、正己烷、乙酸乙酯、正丁醇、三氯甲烷、甲酸、香草醛、硫酸均为分析纯，纯化水、硅胶G板。
3. 方法与结果
3.1. 薄层鉴别
3.1.1. 当归的薄层鉴别
取本品3 ml，蒸干，残渣加入甲醇5 ml，于水浴锅中加热溶解，滤过，滤液加在内径1 cm硅胶柱(100~200目，15 g)上，用200 ml乙酸乙酯洗脱，收集脱洗液，用旋转蒸发仪蒸干，残渣加入甲醇1 ml溶解，作为供试品溶液。按处方除去当归制成阴性样品，按供试品溶液的制备方法制得阴性对照溶液。另取当归对照药材0.5 g，加乙醚20 ml，超声处理10 min，滤过，滤液蒸干，残渣加入甲醇1 ml溶解，作为对照药材溶液。按照《中国药典(2025年版)》薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述三种溶液各10 ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，用正己烷–乙酸乙酯(4:1)作展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。结果显示，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，有相同颜色的斑点，阴性对照品中无相应斑点，提示供试品样品中含有当归，见图1。
(1) (2) (3)
Figure 1. Thin-layer chromatogram for the identification of Angelica sinensis radix (Danggui): (1) Test sample solution; (2) Negative control solution without Angelica sinensis Radix (Danggui); (3) Reference herb solution of Angelice sinensis Radix (Danggui)
图1. 当归薄层鉴别色谱图：(1) 供试品溶液；(2) 缺当归的阴性对照溶液；(3) 当归对照药材溶液
3.1.2. 白芍的薄层鉴别
取本品10 ml，置于分液漏斗中，用水饱和的正丁醇30 ml分3次提取，静置分层，合并上层正丁醇液，蒸干，残渣加入乙醇1 ml溶解，作为供试品溶液。按处方除去白芍制成阴性样品，依据供试品溶液的制备方法制得阴性对照溶液。另取芍药苷对照品1 mg，加乙醇1 m溶解，制得对照品溶液。根据《中国药典(2025年版)》薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述三种溶液各10 ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，用三氯甲烷–乙酸乙酯–甲醇–甲酸(40:5:10:0.2)作展开剂，展开至同一前沿线2次，取出，晾干，均匀喷洒5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。结果显示，供试品色谱的一系列斑点中，其中一点与对照品处于相同位置，且显现相同颜色，阴性对照品中无相应斑点，提示供试品样品中含有白芍，见图2。
Figure 2. Thin-layer chromatogram for the identification of White Peony Root (Baishao): (1) Test sample solution; (2) Negative control solution without White Peony Root (Baishao); (3) Reference standard solution of paeoniflorin
图2. 白芍薄层鉴别色谱图：(1) 供试品溶液；(2) 缺白芍的阴性对照溶液；(3) 芍药苷对照品溶液
3.2. 含量测定
3.2.1. 色谱条件
色谱柱：InertSustain C18 (5 um, 4.6 × 250 mm)；流动相A为水，B为乙腈，按下表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为210 nm；柱温为25℃；流速为1 ml/min。
Table 1. Concentrations of mobile phase
表1. 流动相浓度
时间(分钟) |
流动相A (%) |
流动相B (%) |
0~25 |
75 → 55 |
25 → 45 |
25~40 |
55 |
45 |
40~60 |
55 → 10 |
45 → 90 |
60~75 |
90 |
90 |
3.2.2. 供试品溶液配制
精密量取本品5 ml于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 ml，摇匀，密封，室温静置24 h，过滤；精密量取滤液5 ml，再次精密加入甲醇20 ml，摇匀，密封，室温静置24 h，过滤，滤液蒸干；残渣用甲醇溶解后转移至10 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.2.3. 对照品溶液配制
精密称取柴胡皂苷a对照品3.8 mg、柴胡皂苷d对照品6.1 ml，置于10 ml容量瓶中，加甲醇5 ml溶解后稀释至刻度，摇匀，制得每1 ml含柴胡皂苷a 0.38 mg、柴胡皂苷d 0.61 mg的对照品溶液。
3.2.4. 阴性样品溶液的制备
处方除去柴胡，按解郁养心合剂生产工艺制成阴性样品，按供试品溶液的制备方法制得阴性对照溶液。具体见图3(a)~(c)。
(a)
(b)
(c)
Figure 3. HPLC chromatograms: (a) Test sample of Jieyu Yangxin Decoction; (b) Negative sample without Bupleurum; (c) Reference standards of Saikosaponins a and d
图3. HPLC图：(a) 解郁养心合剂供试品；(b) 缺柴胡阴性样品；(c) 柴胡皂苷a和d对照品
3.2.5. 线性关系
精密吸取每1 ml含柴胡皂苷a 0.38 mg、柴胡皂苷d 0.61mg的对照品溶液0.1 ml、0.2 ml、0.3 ml、0.4 ml、0.5 ml定容到10 ml容量瓶中，分别进样10 μl，绘制纵坐标为对照样品峰面积A，横坐标为相应的对照品浓度C的标准曲线。柴胡皂苷a、d标准曲线方程分别为A1 = 29.06C1 − 3.44，r = 0.9998，A2 = 35.83C2 + 10.61，r = 0.9999，以上指标成分在线性范围内，线性关系良好。
3.2.6. 精密度试验
精密吸取每1 ml含柴胡皂苷a 0.38 mg、柴胡皂苷d 0.61 mg的对照品溶液10 μl，连续进样5次，结果柴胡皂苷a、d峰面积的RSD值分别为0.7%、1.0%，表明仪器和方法具有良好的精密度。
3.2.7. 重复性试验
取批号为20250811的样品5份，制成供试液，测定样品中柴胡皂苷a、d的含量，RSD分别为1.4%、1.1%。
3.2.8. 稳定性试验
将批号为20250811的解郁养心合剂制成供试液，每间隔2 h进样一次，每次10 μl，连续考察12 h，测定柴胡皂苷a、d峰面积，其RSD为0.9%、1.1%。结果表明放置供试液12 h，柴胡皂苷a、d含量稳定。
3.2.9. 加样回收率试验
精密量取不同剂量批号为20250811的解郁养心合剂5份，分别精密加入1 ml浓度为柴胡皂苷a 0.38 mg/ml、柴胡皂苷d 0.61 mg/ml的对照品溶液，按供试品溶液的制备方法制得样品溶液，测定并计算样品中柴胡皂苷a、d的含量及加样回收率，结果见表2。
Table 2. Results of the spiked recovery rate test
表2. 加样回收率试验结果
取样量/ml |
样品中柴胡皂苷a含量/mg |
加入柴胡皂苷a的量/mg |
测得柴胡皂苷a的量/mg |
回收率a/% |
样品中柴胡皂苷d含量/mg |
加入柴胡皂苷d的量/mg |
测得柴胡皂苷d的量/mg |
回收率d/% |
平均回收率/% |
RSD/% |
4 |
0.1562 |
0.3800 |
0.5398 |
100.67 |
0.1400 |
0.6100 |
0.7595 |
101.27 |
99.44 |
1.15 |
5 |
0.1952 |
0.3800 |
0.5668 |
98.54 |
0.1750 |
0.6100 |
0.7890 |
100.51 |
6 |
0.2342 |
0.3800 |
0.6193 |
100.83 |
0.2100 |
0.6100 |
0.7961 |
97.08 |
7 |
0.2733 |
0.3800 |
0.6528 |
99.92 |
0.2450 |
0.6100 |
0.8435 |
98.65 |
8 |
0.3123 |
0.3800 |
0.6791 |
98.09 |
0.2800 |
0.6100 |
0.8797 |
98.84 |
3.2.10. 样品的含量测定
取批号为20250811、20250915、20251027的解郁养心合剂3瓶，按供试品溶液的制备方法制得供试品溶液，按含量测定方法测得3批样品中柴胡皂苷a、d及a + d的含量，结果见表3。
Table 3. Results of determination of Saikosaponin a and d content in samples (mg/ml)
表3. 样品中柴胡皂苷a、d含量测定结果(mg/ml)
批号 |
样品中柴胡皂苷a含量 |
样品中柴胡皂苷d含量 |
样品中柴胡皂苷a + d含量 |
20250811 |
0.1952 |
0.1750 |
0.3702 |
20250915 |
0.1943 |
0.1752 |
0.3695 |
20251027 |
0.1727 |
0.1541 |
0.3238 |
4. 讨论
中药合剂由处方饮片用水提取制成，含有大量的多糖、鞣质、蛋白质等，而对一些脂溶性成分则提取效率较低，且在水煮的过程中挥发油类成分易随水蒸气而损失。对于当归单药的薄层鉴别，常采用乙醚超声提取，而对中药合剂采取乙醚萃取的方法制备供试品溶液，薄层鉴别所需的目标成分可能富集不充分，色谱斑点不清晰。因此，研究经对比后采取硅胶柱洗脱的方法，能除去大量的色素及糖类等大极性化合物，尽可能保留鉴别所需目标成分。在洗脱剂的选择上，对比了乙醚、乙酸乙酯两种溶剂，乙醚洗脱时所需剂量过大且存在毒性，乙酸乙酯洗脱剂量适中，所得供试品溶液能满足薄层鉴别要求，斑点清晰且干扰杂质较少。白芍薄层鉴别时，合剂直接加入乙醇会出现大量沉淀，可能为水煎液中的淀粉、蛋白质、色素等，需要大量乙醇反复沉淀才能去除，使用水饱和的正丁醇萃取制备供试品溶液，方法简便可行。在展开后的薄层色谱图中，与芍药苷Rf值相近的位置有一橙红色斑点，使用20 cm长硅胶板较10 cm硅胶板能获得更好的分离效果，但耗时太长，利用10 cm硅胶板展开2次的方法，能取得同样的分离效果且大大缩短试验时间。在柴胡皂苷含量测定供试品溶液制备时，没有采用前述白芍供试品溶液的制备方法，是考虑水饱和的正丁醇溶液萃取方法重复性偏差较大，且正丁醇沸点较高不宜蒸干，残留溶剂可能对色谱柱造成损伤，因此采用甲醇沉淀制备供试品溶液。在色谱条件的选择时，先尝试0~50 min，25%~75%乙腈梯度洗脱，柴胡皂苷d无法实现基线分离，故减缓柴胡皂苷d出锋时溶液浓度变化，最终实现良好的分离效果。综上所述，本研究制定的解郁养心合剂中当归、白芍的薄层鉴别方法及其中柴胡皂苷a和d的含量HPLC测定法重现性好、分离度较高、目标成分无干扰，可准确地进行质量控制。
鉴于中药制剂成分复杂、活性成分不明确、作用机制尚不清晰等特点，其质量研究日益受到重视。选择适宜的质量研究方法与控制指标，以客观表征中药质量特征，对于指导制剂工艺筛选、实现全过程质量控制及制定科学合理的质量标准具有重要意义[9] [10]，这也会是我们未来进一步研究的目标。
基金项目
十堰市中医医院院内课题：解郁养心合剂制备工艺及质量标准研究。
NOTES
*通讯作者。