1. 引言
新孢子虫病(Neosporosis)是由犬新孢子虫(Neospora canium)引起的一种主要寄生于宿主细胞内的原虫病,1984年首次在挪威的幼犬内发现,1988年Dubey博士将其命名为犬新孢子虫[1] 。牛、羊、马等及多种野生哺乳动物都可以作为它的中间宿主,犬是该寄生虫的终末宿主兼中间宿主 [2] ,可通过垂直传播和水平传播 [3] 。主要造成母牛流产、产死胎以及新生儿的运动神经系统疾病,且临床症状因地区的不同存在着不同的差异。流产特征呈散发性或地方性流行,一年四季均可发生 [3] 。新孢子虫病呈世界性分布,广泛存在于欧洲、美国和新西兰等30个国家。近年来,在我国北京、新疆、青海、吉林和上海等地区均发现有该病的存在 [4] 。
随着马产业的发展和农户养马数量的提高,该病的流行在我国马群中也呈上升趋势,给养殖业也造成了严重的经济损失,如今马匹质量、赛马规模、马术水平也是体现国力的标志 [5] 。然而,患病马常会影响肉、奶等产品的质量,以及马的生育率 [6] ,损害牧民收入,甚者影响马养殖业的健康发展。和静镇的经济支柱产业主要是农业和畜牧业,再者,当地蒙古族(马背民族)较多且都喜欢养殖马匹,这也直接或间接的影响着这里的农户。故对和静镇周围散养马感染新孢子虫情况调查对今后马产业健康稳定的发展具有一定的现实意义。
2. 材料与方法
2.1. 试剂与主要仪器材料
试剂:树脂型基因组DNA提取试剂盒购自北京赛百盛基因技术有限公司;DL2000Marker、2 × Es Taq MasterMix购自北京康为世纪生物科技有限公司。
主要仪器材料:RADIAL20台式高速离心机(西班牙ORTO ALRESA公司);DK-600A型电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司);DYY-III-5型电泳仪(北京六一公司);PCR仪(美国Bio-Rad公司)。
2.2. 引物的合成
参照文献 [7] 合成一对检测新孢子虫病的特异性引物,目的基因全长约635 bp,由上海生物工程有限公司合成。
上游引物TOX4:5’- CGCTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG -3’
下游引物TOX5:5’- CGCTGCAGACACAGTGCATCTGGATT -3’
2.3. 样品采集及全血DNA的提取
2.3.1. 样品采集
样品随机采集于巴音布鲁克镇周边的散养马(N = 56),包括牧民散养的珍贵走马和赛马、使役马等(无任何临床症状)。
2.3.2. 全血DNA的提取
取200 μL新鲜,冷冻或加入各种抗凝剂的血液,放入1.5 mL离心管。加入20 μL Proteinase K溶液涡旋震荡混匀,而后,按照血液基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作,将提取的全血DNA放置于−4℃保存,以做备用。
2.4. 操作方法
PCR是一种诊断新孢子虫病的有效工具 [8] ,以提取的马全血DNA为模板,进行目的片段的扩增,反应体系为25 μL,具体反应体系如下:
10X PCR Buffer 2.5 μL
dNTPs 2 μL (浓度0.2 umol/L)
引物TOX4: 1 μL (浓度0.3 umol/L)
引物TOX5: 1 μL (浓度0.3 umol/L)
Taq DNA聚合酶 0.2 μL (浓度0.625 U)
模板DNA: 2 μL
灭菌双蒸水 16.3 μL
采用的PCR反应程序如下:94℃ 7 min;95℃ 1 min;57℃ 1 min;72℃ 1 min;72℃ 10 min;4℃保存,35个循环。
PCR产物的检测:取适量PCR产物和6 × Loading Buffer上样缓冲液充分混匀,配制1%琼脂糖凝胶电泳检测。拍照后判断结果。
3. 试验结果
3.1. 全血基因组DNA提取结果
严格按照组织基因组快速提取试剂盒的操作步骤,采用蛋白激酶K裂解法提取模板DNA,并取适量对其进行1%琼脂糖凝胶电泳,得到清晰且亮度高的电泳条带(见图1),由此证明模板DNA提取成功。
3.2. 马新孢子虫病PCR检测结果
对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,阳性对照扩增出预期大小的目的条带,阴性对照无条带,检测的56份血样中,其中5份为阳性,因此新孢子虫病感染率为8.93% (5/56),见图2。
4. 讨论与 小结
和静地形呈东西长,南北宽,西北高,东南低,分为山间盆地、山地峡谷和山前平原三部分,总面积39,686平方公里。境内多山、多河,水源丰沛。和静气候属中温带大陆性气候,可利用草场3077万亩,是新疆发展畜牧业生产的一个主要基地。近年来由于新疆马产业的发展,马匹的健康问题日益受到关注,尤其是马作为一种经济动物,它的生产问题就显得尤为重要。流产对于马产业的危害甚重,分析其病因,主要是传染病和寄生虫病引起。众所周知,布病对于家畜危害严重,但在一些调查中发现,部分家畜流产并不是由布病引起。
M:DNA分子质量标准;1~3:全血DNA
Figure 1. Whole blood genomic dna of horse
图1. 马全血部分基因组DNA
M:DNA分子质量标准;1:阳性对照;2:阴性对照;3~10:部分样品PCR产物
Figure 2. PCR examination of equine Neospora
图2. 马新孢子虫PCR检查
新孢子虫病是近几年被世界各国学者和畜牧业工作人员广泛关注和认识的疾病,该病可引起妊娠母畜流产,进而造成巨大的经济损失。由于新孢子虫感染马的报道甚少。因此本研究对和静镇周围散养马感染新孢子虫病情况进行了调查,结果表明,所检样品新孢子虫阳性率为8.93% (5/56),说明该县马匹存在新孢子虫病感染。该结果为和静镇乃至新疆马匹新孢子虫病流行病学提供了数据资料。
由于新孢子虫病常用检测方法为ELISA检测法,因此后续会对采集的相应血清进行新孢子虫抗体检测。
犬作为新孢子虫病的中间宿主及终末宿主,对其它动物(包括马)感染此病起到了至关重要的影响 [9] 。因此,笔者进行马感染新孢子虫情况检查的同时,调查发现在采样点所有畜主家均有养犬现象,且有流浪犬在此周围活动,经犬粪传播了病原,造成了马感染新孢子虫,这与闫双 [10] 等报到结果一致。建议迎来新孢子虫疫苗 [11] 以前,各个饲养马的畜主改善饲养环境,犬畜分离,并定期进行预防性驱虫。
项目基金
自治区科技厅成果处,科技成果转化专项资金项目(项目编号:201454129)资助。