1. 引言
艾叶为菊科植物艾Artemisia argyi Levl. et Vant.的干燥叶，具有温经止血，散寒止痛，祛湿止痒的功效，用于治疗吐血，衄血，崩漏经多，妊娠下血少腹冷痛，经寒不调，宫冷不孕，外治皮肤瘙痒等症 [1] 。近年来，一些地区将同属植物野艾蒿A. lavandulaefolia DC.和北艾A. vulgaris L.的叶混作艾叶药材 [2] [3] 。艾蒿、野艾蒿与艾植物亲缘关系相近，其药材性状相似，难以分辨。目前关于艾叶及混淆品的鉴别研究有药材性状、显微、紫外光谱及红外光谱等 [2] - [13] ，但这些鉴别方法对艾叶及其亲缘关系相近的混淆品，其专属性不够强。近年来，化学指纹图谱技术应用于中药材鉴别已有大量的研究报道，取得较为满意的药材识别效果。虽然有报道 [14] 对艾叶饮片进行HPLC指纹图谱研究，但存在建立的指纹图谱信息量不大，难以较为全面的表征成分复杂的艾叶药材，未能获得艾叶与其亲缘关系相近混淆品药材的鉴别效果。因此，本实验采用HPLC对21批艾叶及其混淆品进行指纹图谱鉴别研究，以期建立信息量大、专属性强的艾叶HPLC指纹图谱鉴别方法，为艾叶药材及其混淆品的鉴别提供参考依据。
2. 材料与仪器
2.1. 材料
艾叶药材样品共16份，经贵阳中医学院王祥培教授鉴定为菊科植物艾Artemisia argyi Levl. et Van.的干燥叶；艾叶混淆品4份，经贵阳中医学院王祥培教授鉴定为菊科植物野艾蒿A. lavandulaefolia DC.和北艾A. vulgaris L.的干燥叶；艾茎1份，经贵阳中医学院王祥培教授鉴定为菊科植物艾Artemisia argyi Levl. et Van.的干燥茎。具体来源见表1。
2.2. 仪器与试剂
Agilent1100型高效液相色谱仪(美国安捷伦)，配有二极管阵列(DAD)检测器，四元泵溶剂洗脱系统，柱温箱，自动进样器；分析天平(型号：AL204-IC/万，METTLER TOLEDO仪器有限公司)；超声波清洗机(型号：HS-10260T，天津市恒奥科技发展有限公司)；数显恒温水浴锅(型号：HH-6，常州澳华仪器有限公司)。《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》(国家药典委员会
2004A
版)，甲醇、乙腈为色谱纯(美国TEDIA)，其余试剂均为分析纯，水为娃哈哈纯净水。
Table 1. Similarity between the leaves and the confusion product
表1. 艾叶与混淆品的相似度
3. 方法与结果
3.1. 色谱条件
Uitimate-C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm)色谱柱；流动相：乙腈(A)-0.05%磷酸水溶液(B)进行线性梯度洗脱(0~8 min, 1%~15% A; 8~18 min, 15%~20% A; 18~36 min, 20%~23% A; 36~45 min, 23%~28% A; 45~60 min, 28%~45% A; 60~80 min, 45%~50% A; 80~90 min, 50%~75% A; 90~100 min, 75%~95% A; 100~110 min, 95%~100% A; 110~120 min, 100% A)；柱温
25 ℃
；检测波长290 nm；流速0.60 mL/min；分析运行时间120 min；进样量5 μL。
3.2. 供试品溶液制备
取艾叶样品粉末1.0 g，精密称定，置于100 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，超声提取两次，每次1 h，滤过，合并滤液，置蒸发皿中于
60 ℃
水浴挥干，残渣用甲醇溶解并定容至10 mL，摇均，用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。
3.3. 精密度试验
取贵州开阳上坝的艾叶样品粉末，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下的色谱条件连续进样6次，结果显示各共有峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD分别在0.12%~2.77%和0.03%~1.17%之间，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱要求。
3.4. 稳定性试验
取贵州开阳上坝的艾叶样品粉末，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下的色谱条件分别在0, 6, 12, 18, 24, 36 h进样检测，结果显示各共有峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD分别在0.08%~2.17%和0.07%~1.40%之间，表明样品溶液在36 h内稳定。
3.5. 重复性试验
取贵州开阳上坝的艾叶样品粉末6份，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下的色谱条件进样分析，结果显示各共有峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD分别在0.14%~2.77%和0.04%~1.28%之间，表明该方法重复性良好。
3.6. 指纹图谱建立
取16批艾叶药材粉末，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下的色谱条件对16批供试品溶液进行检测，测得所有供试品HPLC的色谱图；根据不同供试品测定结果的峰数目、峰值、峰位等相关参数进行比较、分析，制定优化的药材指纹图谱，结果见图1，图2。取4批混淆品及1批艾茎药材粉末，按艾叶的方法制备供试品溶液，进样，获得4批混淆品及1批艾茎药材样品的指纹图谱，见图3。
3.7. 指纹图谱分析
3.7.1. 艾叶药材共有指纹峰的确定
比较不同艾叶药材供试品溶液色谱图的相关参数，以保留时间约为43.617 min的27号峰作为参照峰S，对各批次艾叶药材的指纹图谱进行考察，确定了43个共有峰，结果见图1，图2。
3.7.2. 指纹图谱相似度评价
分别将收集的16批艾叶药材样品的色谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”，进行匹配，时间窗为0.20，采用中位数法考察色谱峰相似度的一致性，结果见表1。分别将4批混淆品及1批艾茎样品的色谱数据导入相似度评价软件，与16批艾叶样品的色谱峰相似度进行比较，结果见表1。根据相似度评价结果，16批艾叶药材样品的相似度大于0.900，而混淆品及艾茎与艾叶比较却低于0.550。
4. 讨论
本实验采用超声和回流提取结合以不同浓度的甲醇与乙醇进行提取考察，发现以甲醇作为溶剂进行超声提取的效率高且色谱峰多，提取2次，每次1 h后基本完全，故拟定本文的供试品溶液制备方法。
对乙腈-水、乙腈-0.10%醋酸水、甲醇-水、甲醇-0.10%醋酸水、甲醇-0.05%磷酸水系统、乙腈-0.05%磷酸水系统及甲醇:乙腈(1:1)-0.05%磷酸水等流动相系统进行考察，发现在乙腈-0.05%磷酸水系统条件下，供试品各峰的分离度较好，基线平稳。采用DAD多通道波长检测，发现在290 nm检测波长条件下，信息量丰富，特征峰较明显。考察
25 ℃
、
30 ℃
、
35 ℃
时柱温条件对色谱峰分离度的影响，发现柱温升高时，峰的分离度降低且分析时间延长，故选择
25 ℃
作为柱温。
Figure 1.The HPLC fingerprint of argy wormwood leaf
图1.艾叶药材HPLC指纹图谱
Figure 2. The HPLC fingerprint of 16 batch argy wormwood leaf
图2. 16批艾叶药材HPLC指纹图谱
(S = 艾叶；A = 艾茎；B、C、D、E = 艾叶混淆品)
Figure 3. The HPLC fingerprint comparison chart of argy wormwood leaf and adulterants
图3. 艾叶药材与混淆品的HPLC指纹图谱比较图
文献[1] [3] 通过叶片的形状及横切面细胞排列和厚壁组织的有无等特征进行艾叶药材的鉴别，但市场上收集的艾叶药材多破碎不完整，对于艾的同株植物其上部叶与下部叶的形态差异较大，且生态环境上的差异，导致不同产地的艾叶形态及显微组织构造多产生变异，并且破碎的艾叶药材不便于性状的观察，也不利于显微横切面的制作及观察，这些因素均增加艾叶药材性状及显微专属性特征鉴别的难度。而通过对收集到的艾叶药材及混淆品进行HPLC指纹图谱研究发现，各批次艾叶药材指纹图谱相似度均大于0.900，有43个共有峰，而艾叶药材与非药用部位及亲缘关系相近的混淆品指纹图谱比较，相似度均低于0.550，共有峰的个数均较少，差异明显，说明本文建立的HPLC指纹图谱，具有方法简便、信息丰富、特征性强等特点，可用于艾叶药材的鉴别，为控制和评价艾叶药材的整体质量提供参考。