1. 引言
观赏植物的花色是其最重要的商品性状之一。花的呈色除花青素苷本身的性质与种类外，还受到花瓣液泡的pH值、助色素的含量以及金属离子的络合作用等因素共同影响 [1] 。尽管自然界的花卉色彩丰富，但却普遍缺少蓝色系的花，蓝色花的基因工程研究一直是近年来的研究热点。蓝色花的产生，首先需要蓝色基因F3′5′H (类黄酮-3′, 5′-羟基化酶)的存在，其直接催化产生蓝色花的主要呈色物质——飞燕草素苷(delphinin)及其衍生物 [2] 。其次，随着液泡pH逐渐升高可使花青素苷呈色由红向蓝转变，偏碱性的液泡pH是蓝色呈现所必需的 [3] ，如花瓣中含有飞燕草素苷的天竺葵(Pelargonium hortorum)和凤仙花(Impatiens balsamina)，由于液泡pH偏酸而无法显现蓝色 [3] 。
目前关于蓝色基因F3′5′H的克隆和功能研究已有很多报道 [4] ，而关于液泡pH的调控研究却很少。矮牵牛PhPH5编码P3A-ATPase的质子泵，其突变直接导致花瓣液泡酸化程度降低，从而使花朵变为蓝色 [5] 。矮牵牛PhPH1编码P3B-ATPase，其自身无H+转运的活性，通过与PH5形成复合体共同作用调控矮牵牛花瓣液泡酸化，最终决定花朵呈色，其突变导致该复合体不能正常工作，而使花瓣显示蓝色 [6] 。
CRISPR/Cas9系统是通过sgRNA介导对靶位点进行定位并利用Cas核酸酶对核酸实现双链断裂(double-strand break, DSB)来实现基因组定点编辑，作为一种新兴的技术已比较成熟，被广泛用于植物功能基因组研究中 [7] 。本实验室的Ma等已成功开发了一套简单、高效和能实现多靶点编辑的植物CRISPR/Cas9载体系统 [8] ，该系统利用重叠PCR方法在体外直接拼接不同靶位点sgRNA的表达盒，然后再用Golden Gate克隆 [9] 或Gibsion克隆 [10] 的方法把多个sgRNA表达盒一步组装到含Cas9表达盒的植物双元载体中。利用该系统已经成功在水稻、拟南芥、杨树等中实现了准确的基因组编辑 [8] [11] 。
烟草NtPH1是同为茄科的矮牵牛PhPH1基因的直系同源基因，两者具有高度的序列一致性，推测具有与PhPH1相似的功能。本研究利用植物CRISPR/Cas9系统成功构建了NtPH1的双靶点敲除载体pCas9-PH1T1T2，为进一步开展NtPH1基因的功能研究，以及利用其进行蓝色花的基因工程操作奠定了基础。
2. 材料与方法
2.1. 材料、菌株与试剂
含Cas9表达盒的双元表达载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H，含sgRNA表达盒载体质粒pYLsgRNA- AtU6-26和pYLsgRNA-AtU6-29，均由本实验室构建和保存。大肠杆菌菌株E. coli DH10B由实验室保存。
高保真DNA聚合酶KOD FX购于TOYOBO；T4 DNA连接酶、限制性内切酶均购于NEB；DNA胶回收试剂盒购于TAKARA；其它试剂均为国产和分析纯。
2.2. 靶位点选择
选择NtPH1第7外显子正义或反义链设计两个20 bp碱基靶序列，两个靶序列PAM序列(NGG)间间隔约60 bp，GC%含量50%~60%，G/C分布均匀。
2.3. 靶位点sgRNA表达盒的体外拼接
以质粒pYLsgRNA-AtU6-26为模板，通用引物UF(5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’)与特异引物R-T1 (5’-ctggatgacgcgattatggcaatcactacttcgactctagc-3’，下划线为靶序列T1)，扩增约470 bp左右的AtU6-26启动子，引物F-T1(5’-ccataatcgcgtcatccagGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’，下划线为靶序列T1)与通用引物gR-R(5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’)扩增约136 bp的gRNA序列，上述PCR产物各取0.2 µL和0.1 µL混合后，用Bsa I位点的通用引物Pps-R (5’-TTCAGAggtctcTACCGACTAGTATGGAAT CGGCAGCAAAGG-3’，下划线为Bsa I位点)和Pgs-2 (5’-AGCGTGggtctcGtcagggTCCATCCACTCCA AGCTC-3’，下划线为Bsa I位点)进行重叠PCR扩增，获得靶点T1的sgRNA表达盒。
以质粒pYLsgRNA-AtU6-29为模板，通用引物UF与特异引物R-T2 (5’-cttcgagggcttaaacttgtcaatca ctacttcgactctagc-3’，下划线为靶序列T2)，扩增约400 bp左右的AtU6-29启动子，引物F-T2 (5’-acaa gtttaagccctcgaagGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’，下划线为靶序列T2)与通用引物gR-R扩增约136 bp的gRNA序列，上述PCR产物各取0.2 µL和0.1 µL混合后，用Bsa I位点的通用引物Pps-2和Pgs-L进行重叠PCR扩增，获得靶点T2的sgRNA表达盒。PCR扩增体系和条件按照KOD FX推荐进行。
2.4. 双元载体上两个靶位点sgRNA表达盒的Golden Gate法组装
由于Bsa I位点切开后，再连上形成的新位点已不能被Bsa I切割，因此直接把双元载体质粒pYLCRISPR/Cas9Pubi-H与T1和T2的sgRNA表达盒，直接混合后，加入Bsa I内切酶和T4 DNA连接酶，同时进行酶切连接。15 µL反应体系为：1 µL 10 x CutSmart buffer，80 ng pYLCRISPR/Cas9Pubi-H质粒，ATP (终浓度1.0 mM)，T1，T2 sgRNA表达盒各30 ng，10 U Bsa I内切酶，40 U T4 DNA连接酶，不足的用水补足。反应条件：在可调温度的热板或PCR仪上，先3个循环(37℃ 10 min，10℃ 5 min，20℃ 5 min)，再进行10个循环(37℃ 3 min，10℃ 5 min，20℃ 5 min)。反应产物透析后直接电击DH10B，用靶点特异引物T1 (5’-ccataatcgcgtcatccag-3’)和T2 (5’-cttcgagggcttaaacttgt-3’)筛选阳性克隆，最后提质粒用Spe I酶切检测，测序最终确定。整个载体构建的流程如图1。
3. 结果与分析
3.1. 靶位点序列的确定
根据NtPH1第7外显子序列，分别搜索PAM序列NGG，或其互补链的CCN，并且靶位点GC%含量在45%~60%之间，最终确定两个靶位点序列T1和T2 (图2)，其中T1是CCN的互补链，距离T2位点的PAM约有60 bp左右。
Figure 1. Schematic diagram for construction of plant CRISPR/Cas9 vector system: (a) Golden Gate cloning using IIS class Bsa I; (b) in vitro splicing of different sgRNAs and one-step Golden Gate cloning
图1. 植物CRISPR/Cas9双靶点敲除载体构建示意图：(a) 利用IIS型限制性内切酶Bsa I的Golden Gate克隆原理；(b) 不同sgRNA表达盒的体外拼接和利用Golden Gate克隆方法一步连入双元表达载体中
Figure 2. The location and characterization of two target sequences
图2. 靶序列位置与特征
3.2. sgRNA表达盒直接拼接
用通用引物UF与特异引物R-T1，扩增pYLsgRNA-AtU6-26质粒，获得预期约470 bp左右的AtU6-26启动子，引物F-T1与通用引物gR-R扩增获得预期约136 bp的gRNA序列(图3(a))。上述PCR产物混合后，通用引物Pps-R和Pgs-2进行重叠PCR扩增，获得预期600 bp左右的T1 sgRNA表达盒(图3(b))。
用通用引物UF与特异引物R-T2，扩增pYLsgRNA-AtU6-29质粒，获得预期约400 bp左右的AtU6-29启动子，引物F-T2与通用引物gR-R扩增获得预期约136 bp的gRNA序列(图3(a))。上述PCR产物混合后，通用引物Pps-2和Pgs-L进行重叠PCR扩增，获得预期530 bp左右T2 sgRNA表达盒(图3(b))。
3.3. NtPH1基因的双靶点敲除载体pCas9-PH1T1T2构建
Golden Gate克隆法就是利用限制性内切酶IIS这类酶，如Bsa I，其识别位点与切割位点是分离的，别且能产生4个任意碱基的突出末端，其酶切连接产物能够实现无缝连接，和产生新的不被Bsa I识别的位点，是一种广泛使用的方法。把pYLCRISPR/Cas9Pubi-H与T1和T2的sgRNA表达盒纯化产物混合后，边切边连，产物转化大肠杆菌DH10B后，随机挑选12个重组克隆，用靶点特异引物T1/T2进行PCR筛选，结果显示，12个克隆都能扩出预期大小的带(图4)，说明这种方法具有较高的连接效率。
进一步提取PCR阳性克隆的质粒，用Spe I酶切后，产生预期1.2 kb大小的两个sgRNA表达盒的连接带(图5)，最后测序确定，表明NtPH1基因的双靶点敲除载体pCas9-PH1T1T2已被成功构建。
(a) (b)
Figure 3. In vitro splicing of sgRNA cassette: (a) PCR amplifying promoters and sgRNAs; (b) Overlapping PCR products of sgRNA cassettes
图3. sgRNA表达盒体外重叠PCR拼接：(a) 含靶序列重叠区的启动子和sgRNA PCR产物；(b) sgRNA表达盒拼接PCR
Figure 4. The colony-screening PCR of pCas9-PH1T1T2 vector
图4. pCas9-PH1T1T2载体的菌落PCR筛选
Figure 5. Restriciton enzyme analysis of pCas9-PH1T1T2 vector
图5. pCas9-PH1T1T2载体的酶切鉴定
4. 讨论
植物基因功能研究，采用的方法主要是超量表达和RNAi干涉的方法。其中，由于RNAi是转录后水平的调控，其对目标基因转录的抑制作用差异较大、特异性较差，效果也不理想 [8] 。而CRISPR/Cas9系统能够实现以往难以做到的基因组定点编辑，能够实现基因组水平上的目标基因的准确敲出，直接获得突变体。作为一种新兴的基因组定点编辑技术，CRISPR/Cas9系统已广泛应用于植物基因功能的研究中 [7] 。
本研究所使用的植物CRISPR/Cas9基因编辑载体系统，与目前的一些植物编辑载体系统相比，具有更大的优势和特点。如与Zhou等的系 [12] 统相比，我们的这套载体系统具有更加简单、快速高效的特点，不同靶位点的sgRNA表达盒，是体外拼接的，无需进行一次体内转化，多个sgRNA表达盒能够通过Golden Gate克隆或Gibsion克隆的方法，一步组装到双元载体上，只需要一次转化大肠杆菌感受态，就能实现多基因多靶点的载体构建。由于sgRNA对靶位点的结合能力会影响编辑效率，所以在选择靶位点时要尽量提高靶序列的GC含量(一般50%~60%)，避免与sgRNA形成二级结构 [8] 。靶位点的选择，除了正义链上的NGG外，还可以考虑正义链上CCN (对应反义链上的NGG)，并且双靶点之间如果间隔几十个碱基，则这两个靶位点间的序列被删除突变的几率更大。
蓝色花的形成除了需要蓝色基因F3′5′H外，花瓣液泡pH的偏碱性也是一个重要的条件 [3] [5] [6] 。烟草NtPH1基因是同为茄科的矮牵牛PhPH1基因 [6] 的直系同源基因，可能具有相似的对液泡pH的调控作用，对于其功能的研究也尚未报道。本研究已成功构建了NtPH1基因的双靶点敲除载体pCas9-PH1T1T2，下一步将利用农杆菌介导的叶盘转化法，转化入烟草中，研究其对液泡pH的调控作用，为蓝色花基因工程研究打下基础。
5. 结论
利用本实验室开发的高效CRISPR/Cas9系统，成功构建了烟草NtPH1基因的双靶点基因组敲除载体，为进一步研究其功能奠定了基础。
基因项目
国家级大学生创新创业训练计划项目(201610564006)；广东省公益研究与能力建设项目(2016A020210084)。