1. 引言
芭蕉根为芭蕉科植物芭蕉(Musa basjoo Sied.et Zucc.)的干燥根茎，为贵州省的民族习用药材 [1] [2] 。文献报道 [3] [4] [5] ，芭蕉根含有羽扇豆酮。现代研究表明 [6] [7] [8] 羽扇豆酮具有抑制α-葡萄糖苷酶(α-Glu)、乙酰胆碱脂酶(AchE)及蛋白酪氨酸磷酸酶1B (PTP1B)活性与抗氧化作用。课题组徐锋等 [3] 研究发现羽扇豆酮提取物具有较为明显降血糖及降糖化血红蛋白的药效作用，但羽扇豆酮提取物还未建立科学可靠的含量测定方法，难以对其进行质量控制，也缺乏其纯度的评价，不利于羽扇豆酮提取物抗糖尿病新药的开发研究。因此，本实验从芭蕉根中分离出三批羽扇豆酮提取物样品，采用高效液相色谱法(HPLC)对其羽扇豆酮的含量进行测定，以期为羽扇豆酮提取物抗糖尿病新药研究及其质量控制提供基础。
2. 实验材料与仪器
2.1. 实验材料
羽扇豆酮提取物样品是由贵阳中医学院生药实验室从芭蕉根药材中提取得到，共3批，第一批分离的时间为2014年6月，第二批分离的时间为2014年11月，第三批分离的时间为2015年4月，试验分别均匀取每批样品3份，共9份样品，见表2。
2.2. 仪器
日本岛津LC-20AT高效液相色谱仪(HPD-M
20A
紫外可见检测器，LC solution色谱工作站)；AUY220分析天平(日本岛津)；HS-10260T超声波清洗机(天津市恒奥科技发展有限公司)；HH-6数显恒温水浴锅(常州澳华仪器有限公司)；Diamonsil-C18色谱柱(
4.6 mm
×
250 mm
, 5 μm)。
2.3. 试药
试剂：甲醇、乙腈为色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司生产；娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)，其余所用试剂均为分析纯。
对照品：羽扇豆酮对照品为贵阳中医学院生药实验室提取分离而得，纯度 ≥ 98% (面积归一化法得到)。
3. 实验方法与结果
3.1. 色谱条件的选择
3.1.1.
试验波长的选择
徐峰等 [3] 用RP-HPLC法测定了芭蕉根内的羽扇豆酮含量，作者通过对羽扇豆酮对照品进行全波段紫外扫描，结果发现羽扇豆酮在210 nm左右吸收较强，且分别比较206 nm、210 nm、290 nm等波长下芭蕉根中羽扇豆酮的理论塔板数及其峰面积，结果证明在波长206 nm处羽扇豆酮的理论塔板及峰面积达到最优，且基线也平稳，故意本试验选择206 nm为测定其含量的波长。
3.1.2. 试验温度的选择
试验考察了
25 ℃
、
30 ℃
两个温度，结果发现羽扇豆酮样品在
25 ℃
时可以达到较好的分离，且理论塔板数最高，故试验以
25 ℃
作为样品含测的温度。
3.1.3. 试验流速的选择
试验分别考察了0.8 mL/min、1 mL/min的流速，结果表明试验流速在1 mL/min时分离效果好，分析时间短，故以1 mL/min的流速进行试验。
3.1.4. 流动相的选择
流动相考察了甲醇:乙腈 = 1:1 (v:v)单泵和双泵的分离效果，结果以甲醇:乙腈 = 1:1 (v:v)单泵的基线稳定。
3.1.5.
色谱条件的确定
通过上述色谱条件的优选，最终确定的色谱条件为：Diamonsil-C18色谱柱(4.6 mm ×
250 mm,
5 μm)，流动相为：甲醇:乙腈(1:1)单泵，流速1 mL/min，柱温
25 ℃
，检测波长：206 nm。
3.2. 系统适应性试验
3.2.1.
对照品的制备
取羽扇豆酮对照品约10 mg，精密称定，加甲醇配制成每1 mL含464.00 μg的对照品溶液。
3.2.2.
样品溶液的制备
取分离得到的3批羽扇豆酮提取物样品约10 mg，每批样品均匀取三份样，精密称定，置于25 mL容量瓶内，加甲醇适量，超声溶解，加甲醇至刻度，摇均，用0.22 μm的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。
3.2.3.
空白溶液的制备
以甲醇溶液作为空白试剂。
3.2.4.
实验测定方法
分别精密吸取对照品溶液10 μL、样品溶液10 μL、空白溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，在上述拟定的色谱条件下进样分析，羽扇豆酮的理论塔板数不低于2500。结果见图1。
3.2.5. 线性关系的考察
取不同浓度的羽扇豆酮对照品(139.2、278.4、417.6、559.8、696.0、839.2 μg/mL)，按
“
3.
1.5
”项下的实验条件进样检测，记录峰面积。以峰面积(A)为纵坐标，浓度(μg/mL)为横坐标绘制标准曲线，得到标准曲线的回归方程为y = 3393.9x − 55776，R2 = 0.9986。结果表明，羽扇豆酮进样量在139.2 μg/mL~839.2 μg/mL之间与峰面积呈良好的线性关系。
Figure 1. The maps of solvent blank, standard and sample ((a) is solvent blank; (b) as standard substance; (c) for the sample)
图1. 空白溶剂、对照品、样品图谱((a)为溶剂空白；(b)为对照品；(c)为样品)
3.2.6.
精密度试验
精密吸取羽扇豆酮对照品溶液10 μL，按“
3.
1.5
”
项下的色谱条件注入液相色谱仪，重复6次，记录保留时间和峰面积。结果表明，羽扇豆酮保留时间和峰面积的RSD (%)值分别为0.08和0.56，表明仪器的精密度良好。
3.2.7.
稳定性试验
精密吸取9号样品溶液10 μL，按
“
3.
1.5
”项下的色谱条件注入液相色谱仪，分别测定样品溶解后0、2、4、6、8、10 h的峰面积及保留时间，记录保留时间和峰面积，并计算其RSD值，结果表明样品峰面积及RSD (%)值分别为0.20、2.82，样品稳定性符合要求。
3.2.8.
重复性试验
取第三批羽扇豆酮6份，每份约10 mg精密称定，按“
3.
2.2
”
项下的供试品溶液制备方法操作，吸取供试品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，按“3.
1.5 ”
项下的色谱条件测定峰面积，按外标一点法计算出各样品中羽扇豆酮含量99.29%，并求出相对标准偏差RSD (%)，其RSD (%)均小于3% (n = 6)，故(试验)重现性良好。
3.2.9. 加样回收率试验
取重复性试验的羽扇豆酮样品6份于10 mL容量瓶内，每份约10 mg，精密称定，加甲醇至刻度，精密量取5 mL于25 mL容量瓶内，加入羽扇豆酮对照品适量，加甲醇至刻度，取供试品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，按“
3.
1.5
”
色谱条件，测定峰面积，计算出回收率，计算公式：回收率 = [测得量(μg) − 样品中含对应对照品的量(μg)] ÷ 对照品加入量(μg) × 100%。结果表明羽扇豆酮平均回收率在95%~ 105%之间，其RSD (%)均小于3% (n = 6)，表明回收率符合要求。见表1。
3.2.10. 9份样品的含量测定
分别取9份样品及对照品溶液10 μL，按“
3.
1.5
”
项下色谱条件操作，测定羽扇豆酮的含量。结果见表2。
4. 讨论
徐峰等 [3] 测定了芭蕉根药材中羽扇豆酮的含量，并对芭蕉根中羽扇豆酮色谱条件进行了系列的考察，本文也分别对流速、波长、流动相等进行了考察，波长和流动相的结果基本一致，但本实验的流速在1 mL/min时能够达到快速的分离效果。
Table 1. Results of the average recovery
表1. 加样回收率结果
Table 2. The results for content of lupenone extract
表2. 羽扇豆酮提取物的含量测定结果
羽扇豆酮具有较好的抗糖尿病活性，本文测定了三批从芭蕉根中提取得到的羽扇豆酮提取物，其羽扇豆酮的含量分别为98.27%、97.40%、99.29%，可用于羽扇豆酮抗糖尿病的新药开发研究。
分离于2014年6月、2014年11月的羽扇豆酮提取物样品的含量均没有分离于2015年4月份的样品的纯度高，说明羽扇豆酮样品的稳定性可能会受到外界因素的干扰，故应注意样品的存放环境，避免其分解，保证药品的有效性和安全性。
本文建立的羽扇豆酮提取物HPLC含量测定方法，具有快速，简便，重现性好，回收率高等特点，可用于羽扇豆酮提取物的质量控制。
基金项目
1) 国家自然科学基金，项目编号：81260686；2) 贵州省优秀青年科技人才培养对象专项资金，项目编号：黔科合人字(2013)46号；3) 贵州省中药现代化公关计划项目，项目编号：黔科合ZY[2012]3016号。
*通讯作者。