1. 引言
多溴联苯醚(polybrominated diphenyl ethers，简称PBDEs)是一种添加型溴代阻燃剂，曾广泛应用于塑料、纺织品和泡沫等产品中。根据Br取代数目及取代位置的不同，PBDEs共有209种同系物 [1] 。PBDEs在环境中难以自然降解，可在生物体内产生累积，并可通过食物链进行富集。PBDEs的大量生产和使用导致其广泛存在于各种环境介质中 [2] [3] [4] 。研究表明，1981~2000年间加拿大北极环斑海豹(Phoca hispida)体内PBDEs浓度一直处于增长趋势，科学家预计在2050年PBDEs将成为该生物体内最主要的有机卤素化合物 [5] 。
高溴代联苯醚可以微生物降解生成毒性更强的低溴代联苯醚。Rayne等 [6] 对PBDEs的厌氧微生物降解进行了研究，结果表明BDE-15可以在污水厌氧处理过程中脱溴生成BDE-3和联苯醚。Gerecke等 [7] 以城市污水处理厂消化污泥为接种物，对BDE-209进行降解，在培养基质中检测到了2种九溴联苯醚和6种八溴联苯醚同系物，证明BDE-209发生了脱溴降解。He等 [8] 研究了厌氧菌Sulfurospirillum multivorans和Dehalococcoides sp.对十溴联苯醚(deca-BDE)和八溴联苯醚(octa-BDE)的降解情况。Sulfurospirillum multivorans可降解deca-BDE，但不能降解octa-BDE；相反，Dehalococcoides sp.可以降解octa-BDE，但不能降解deca-BDE。Lee等 [9] 采集不同区域的土壤和沉积物用于octa-BDE的降解研究，发现octa-BDE在大部分样品中可发生微生物脱溴过程。Tokarz等 [10] 和Huang等 [11] 对PBDEs的厌氧降解途径进行了较为详细的研究，高溴代联苯醚在还原脱溴作用下，可脱去邻位、间位或对位的溴原子，生成相应的低溴代产物。
城市污泥中普遍含有PBDEs [12] ，随着污泥的排放，这些持久性有机污染物将可能会再次进入环境中，对生态系统和人类形成潜在危害。目前对污泥中PBDEs厌氧生物降解的研究多集中在采用序批式实验培养方法，但是对于工程实际中的污泥厌氧消化厂，由于在一定的工艺参数下连续运行，与序批式的培养方式有很大不同。本论文拟通过建立和运行实验室规模的污泥厌氧消化反应器，来探讨污泥厌氧消化过程中PBDEs的降解过程。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
多溴联苯醚标准物质：BDE-17、28、33、47、49、66、99、100、138、153、154、183、190、196、203、206、207、208和209购自美国Accustandard公司。回收率指示物标样：BDE-50和BDE-172及内标BDE-118和BDE-128均购自美国Accustandard公司。丙酮、正己烷和二氯甲烷均为色谱纯级，购自德国CNW公司。
2.2. 实验装置
实验所用污泥厌氧消化实验装置由钢材制成，设有内外两腔，外腔中注满水，通过连接的加热和温控装置使内腔保持恒定的温度(35℃ ± 1℃)。内腔容积为6 L，是污泥进行厌氧消化反应的场所，在外腔的保护下，可以在运行中维持良好的厌氧状态。该厌氧消化反应器连有搅拌装置，可设定搅拌速率，实现反应物不同程度的混匀。进出料口采用密封设计，可以防止进出污泥的过程中有气体进入或泄露。内腔设有一个气体出口，与湿式气体流量计相连，用来测量反应器运行过程中气体的产量。
2.3. 实验方法
污泥厌氧硝化反应装置运行经历驯化和反应两个阶段，驯化阶段所用污泥来自上海安亭污水处理厂。首先在反应器中加入6 kg安亭污泥，然后每天进出安亭污泥300 g，反应器转速设为60 rmp，每10 min搅拌1 min，使反应物充分混合。实验过程中每天记录气体产生量，直到反应器厌氧消化达到稳定状态。反应阶段每天向反应器加入300 g实验污泥(取自上海白龙港污水处理厂)，运行条件和驯化阶段污泥相同，反应阶段持续3个污泥龄，共60 d。在反应阶段，每天记录气体产量，每3 d测定pH、总固体含量(TS)、挥发性固体含量(VS)、总氨氮(TAN)和总碱度(TA，以CaCO3计)等指标。同时，每天采集反应器出污泥样品，用于后续PBDEs测定和16S rDNA高通量测序分析。实验污泥样品每隔15 d采集一次，共采集5次。接种污泥在驯化阶段结束时，平行采集3次，用于监控储存期间污泥中PBDEs的变化。在反应阶段，每天记录气体产量，同时采集反应器内污泥样品，用于后续PBDEs测定和16S rDNA高通量测序分析。
2.4. 污泥基本指标分析
污泥pH由Mettler Toledo FE20型pH计直接测得，TS、VS和TAN的测定方法参照美国公共卫生协会(APHA)发布的《水和废水标准检验法》(第19版)。为了减少色度和浊度的影响，TA通过自动碱度滴定仪测定，滴定终点pH设为4.3。
2.5. 多溴联苯醚的分析
污泥中PBDEs的分析参考文献 [12] 中报道的方法，即污泥样品经冷冻干燥48 h后研磨，过60目筛。取约0.2 g污泥样品，加入100 uL回标(BDE-52, 172)，用110 mL二氯甲烷索氏提取48 h。向提取液中加入2 mL浓H2SO4以去除污泥中的有机质组份，静止分层后，将有机层再次通过凝胶色谱柱净化。之后，向提取液中加入Cu片以去除其中的硫。样品浓缩后，加入内标(BDE-118, 128)，用于后续的仪器分析。PBDEs的测定使用气相色谱质谱联用仪(Agilent 7890A/5975C)，色谱柱为DB-5(30 m × 0.25 mm × 0.25 µm, J & W Scientific)。低溴联苯醚(三至七溴联苯醚，BDE-17、28、33、47、49、66、99、100、138、153、154、183和190)的色谱柱升温程序为：初始温度80℃ (保持2 min)；之后12℃/min升温到140℃，然后5℃/min升温到280℃(保持5 min)；后运行300℃(保持15 min)。高溴联苯醚(八至十溴联苯醚，BDE-196、203、206、207、208和209)的色谱柱升温程序为：初始温度110℃(保持1 min)；然后10℃/min升温到290℃ (保持11 min)；后运行300℃ (保持15 min)。载气为高纯氦气，色谱柱流速为1.36 mL/min，进样口温度为280℃，进样量1 µL，进样方式为不分流进样。电离方式选择负化学电离模式，反应气为甲烷，离子源温度200℃。采用选择性离子检测模式，除BDE-209外，所有化合物的扫描离子为79、81；BDE-209的扫描离子为79、81、486.70和488.70。
2.6. 16S rDNA测序
以5-50 ng DNA为模板，PCR扩增细菌16S rDNA上包括V3、V4和V5的3个高度可变区。通过PCR向16S rDNA的PCR产物末端加上带有Index的接头。其中，V3和V4高度可变区进行扩增的正向引物包含序列“CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT”，进行扩增的反相引物包含序列“GGACTAC NVGGGTWTCTAATCC”。V4和V5高度可变区进行扩增的正向引物包含序列“GTGYCAGCMGCCGC GGTAA”，进行扩增的反相引物包含序列“CTTGTGCGGKCCCCCGYCAATTC”。然后，使用生物分析仪(Agilent 2100)检测文库质量，并且通过Qubit和实时定量PCR (Applied Biosystems)检测文库浓度。DNA文库混合后，进行2 × 250 bp双端测序，并读取序列信息，最后在Illumina basespace云端计算平台进行初始分类分析。
2.7. 质量控制与保障
污泥样品分析过程中，同时分析方法空白、加标空白及其平行样来进行质量控制和质量保证。每个样品中均加入回收率指示物(BDE-50和BDE-172)，其回收率为分别为99.29% ± %8.54%和87.02% ± %6.48%。以干重计，目标物BDE-17、28 + 33、47、49、66、99、100、138、153、154、183、190、196、203、206、207、208和209的方法检出限依次为0.15、0.37、0.17、0.07、0.17、0.15、0.11、0.20、0.10、0.09、0.15、0.09、0.50、0.20、0.54、1.3、0.90和0.59 ng/g。样品中PBDEs同系物通读低于其检测限时，以1/2检测限计。样品浓度均扣除空白值，且不经回收率校正。
2.8. 数据分析
实验所用污泥厌氧消化实验装置由钢材制成，设有内外两腔，外腔中注满水，通过连接的加热和温控装置使内腔保持恒定的温度(35℃ ± 1℃)。内腔容积为6 L，是污泥进行厌氧消化反应的场所，在外腔的保护下，可以在运行中维持良好的厌氧状态。该厌氧消化反应器连有搅拌装置，可设定搅拌速率，实现反应物不同程度的混匀。进出料口采用密封设计，可以防止进出污泥的过程中有气体进入或泄露。内腔设有一个气体出口，与湿式气体流量计相连，用来测量反应器运行过程中气体的产量。
2.8.1. 污泥中PBDEs质量的变化
厌氧消化反应中污泥所含PBDEs质量的变化由其浓度计算得到，如公式(1)所示。
(1)
其中，∆M表示污泥中PBDEs质量的日变化量(μg)，∆C表示污泥中PBDEs浓度的日变化量(ng/g dw)，V表示厌氧消化反应器体积(L，此值恒定为6 L)，θ表示污泥的含水率(测定值为18.6%，假定反应过程中该值恒定)，k表示单位转换系数。
污泥中PBDEs浓度的变化可由公式(2)计算得到。
(2)
其中，
表示反应第i天污泥中PBDEs的测定值(ng/g dw)，
表示反应第i天污泥中PBDEs的预测值(ng/g dw)，可由公式(3)计算得到。
(3)
其中，
表示反应第
天污泥中PBDEs的测定值(ng/g dw)，ν表示每天加入的污泥量(L，此值恒定为0.3 L，假定300 g污泥的体积为0.3 L)。
2.8.2. 污泥中PBDEs所含溴元素摩尔数(物质的量)
厌氧消化污泥中PBDEs所含溴元素摩尔数可由公式(4)计算得到。
(4)
其中，
表示反应第i天污泥中PBDEs所含Br摩尔数的测定值(μmol)，m表示PBDEs各同系物所含的溴原子个数，MW表示PBDEs各同系物的分子量(g/mol)。
另外，我们假定污泥中的PBDEs在厌氧消化反应中未发生降解，此时可以根据公式(5)计算得到PBDEs所含Br摩尔数的预测值
(5)
其中，
表示反应第i天污泥中PBDEs所含Br摩尔数的预测值(μmol)，∆ni表示反应第i天污泥中PBDEs所含Br摩尔数的变化值(μmol)，可由公式(6)计算得到。
(6)
3. 结果与讨论
3.1. 污泥的基本性质
接种污泥(即驯化后污泥)和实验污泥(即厌氧消化反应所用污泥)的基本性质如表1所示。接种污泥和实验污泥的pH初始值分别为8.0和7.5，适于进行厌氧消化反应 [13] 。两种污泥的TS含量均大于15%，属于高含固率污泥，VS的含量范围为7.7%~11.8%。接种污泥中TAN和TA分别为3530 mg/L和11,200 mg/L，相应地，实验污泥中TAN和TA分别为2690 mg/L和9010 mg/L。
厌氧消化过程中污泥pH [14] 、VS/TS [15] 、TAN [16] 、TA [17] 的变化情况可用来判断反应的稳定性。
通常，在反应的初始阶段(0~20 d，第I泥龄)，这些指标的变化范围较大，而在反应后期(如40~60 d，第III泥龄)变化较小。例如，初始阶段污泥的pH值在8.0~8.4之间；反应后期pH值相对稳定，在8.0左右。同样，初始阶段VS/TS变化幅度较大(39.2%~51.3%)，反应后期趋于稳定，其平均值为48.8%，标准偏差仅为0.2%。这说明在初始阶段随着实验污泥的加入，改变了由接种污泥形成的厌氧消化反应平衡，导致系统处于不稳定状态。经过两个泥龄(40天)的运行，系统达到稳定状态。在反应稳定阶段(40~60 d，第III泥龄)，反应器每天产气量的平均值为7.2 L。
3.2. 污泥中多溴联苯醚的含量
接种污泥和实验污泥中19种PBDEs同系物(BDE-17、28、33、47、49、66、99、100、138、153、154、183、190、196、203、206、207、208和209)的含量如表2所示。每种目标物均可以在污泥样品中检测到，表明PBDEs已广泛存在于上海市政污泥中，这与先前的研究结果相似 [12] 。以干重计，接种污
泥中19种PBDEs的总浓度(
)为357 ng/g dw，远远低于实验污泥中PBDEs的总含量(19,000 ng/g
dw)，这可能与两个污水处理厂的污水来源有关。两种污泥样品中，十溴联苯醚(BDE-209)都占绝对比例，分别为92.1% (接种污泥)和99.9% (实验污泥)，然后依次是BDE-207、208、206、203、193、99和47等。污泥中PBDEs同系物分布特征主要与我国大量生产和使用十溴联苯醚工业品有关，其主要成份是BDE-209。在我国其它环境介质如土壤 [18] 、沉积物 [19] 和室内灰尘 [20] 等样品中，也发现了类似的分布特征。
Table 1. Basic characteristics of inoculated and experimental sludge
表1. 接种污泥和实验污泥的基本性质
Table 2. The concentrations of polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) in inoculated and experimental sludge
表2. 接种污泥和实验污泥中多溴联苯醚的含量
3.3. 污泥厌氧消化过程中多溴联苯醚的变化
根据污泥中PBDEs同系物的分布特征，该部分选择主要目标物(BDE-209、208、207、206、203、196、183、153、138、99、47和28)作为对象，研究其在污泥厌氧消化过程中PBDEs的变化规律。
对于厌氧消化反应器内污泥中的BDE-209，存在两种来源。其一是实验污泥的添加导致其不断增加，其二是微生物的降解导致其逐渐减少，二者在不同反应阶段对BDE-209质量变化的贡献不同，致使BDE-209质量呈现上升或下降的趋势(图1)。在第I泥龄和第II泥龄阶段初期，BDE-209质量呈现增加现象，主要是因为该物质在实验污泥中的浓度(18300 ng/g dw)远远高于接种污泥含量(329 ng/g dw)，会迅速增加反应器内BDE-209的质量，而此时厌氧反应尚未稳定，微生物的降解程度可能相对较低。在第III泥龄阶段，厌氧反应已经稳定，微生物酶活性增强，BDE-209的质量则呈现下降趋势，平均减少7820 μg。若考虑整个厌氧反应过程中(0~60 d)BDE-209质量的减少情况，则减少量约为19,600 μg，约占总质量的67.5%，表明在60天的厌氧消化过程中，污泥含有的BDE-209有67.5%发生了降解。
导致其它PBDEs同系物质量发生变化的有三部分作用，即实验污泥的添加、BDE-209的脱溴生成、微生物的降解。总体上，这些同系物呈现出不同的变化规律(图1)。BDE-208和207在第I泥龄阶段均出现了减少趋势，表明微生物产生的降解作用要大于实验污泥的添加和高溴代PBDEs的脱溴生成作用之和。在第I和III泥龄阶段，BDE-208和207的质量处于增加状态。对于BDE-203和196，在第I和II泥龄阶段均呈现减少现象，但绝对质量变化不大，平均值分别为1.6 μg和2.9 μg，在第III泥龄阶段开始增加。其余的PBDEs，包括BDE-206、183、153、138、99、47、28，其质量在整个消化反应过程中一直处于增加状态，平均增加量分别为0.55、0.34、0.12、0.38、0.68和0.33 μg。接种污泥(即驯化后污泥)和实验污泥(即厌氧消化反应所用污泥)的基本性质如表1所示。接种污泥和实验污泥的pH初始值分别为8.0。
3.4. 污泥中BDE-209的降解产物
低溴代PBDEs质量的增加表明了BDE-209在厌氧消化反应过程中发生了脱溴降解。前人研究表明，含卤化合物可以在厌氧条件下可以进行还原脱卤降解 [10] [21] 。在这些反应中，含卤化合物通常作为微生物呼吸和共代谢过程的电子受体。在本研究中，三种九溴代同系物BDE-208、207和206质量的增加幅度较大，平均值分别为11.8、106和179 μg，说明BDE-209首先脱溴生成九溴化合物。另外，BDE-206和207质量的增加量约为BDE-208的十倍，根据化合物分子结构，推断出BDE-209脱溴降解主要发生在邻位和间位溴原子上。Lee等在共培养菌GY2(由Dehalococcoides和Desulfovibrio组成)快速降解BDE-47、99和100过程中，也发现邻位上的溴原子会被优先脱去 [22] 。然后，Tokarz等以沉积物为培养基质对BDE-209进行厌氧降解，观察到三种九溴同系物(BDE-206、207和208)均有明显增加，脱溴程度与溴原子位置无明显关系 [10] 。也有研究发现，厌氧条件下BDE-209的降解主要发生在对位和间位，生成BDE-208和BDE-207，而邻位脱溴产物BDE-206没有明显增加 [23] 。厌氧降解过程中PBDEs脱溴位置的差别可能与微生物种类有关，其具体机理有待于进一步研究 [24] 。
此外，我们还分析了污泥厌氧消化过程中PBDEs所含溴元素的变化规律，如图2所示。在反应初始，反应器中仅有接种污泥，此时溴元素含量为4.1 μmol (以物质的量计)。随着实验污泥的加入，溴元素的含量逐渐增多。在第I泥龄阶段结束时，溴元素含量达到102 μmol，增加超过20倍；然而在第II泥龄阶段，溴元素含量变化不大，在100~201 μmol之间(平均值为152 μmol)，并随反应时间延长有减少趋势。在第III泥龄阶段，厌氧消化反应进入稳定阶段，溴元素含量也相对稳定，在64.5~166 μmol之间，平均值为123 μmol，略低于第II泥龄阶段的平均值。同时，假定污泥中PBDEs在未发生生物降解情况下，我们计算了所含溴元素的物质的量，可以发现其随着实验污泥的加入，一直处于增加状态。在第I泥龄和第II泥龄阶段前半段(30 d)，溴元素的理论值和实测值基本相同，表明PBDEs从高溴代同系物全部脱
Figure 1. The mass variation of PBDEs during anaerobic digestion of sewage sludge
图1. 污泥厌氧消化过程中多溴联苯醚同系物总质量变化率
溴生成低溴代同系物，即污泥中PBDEs主要组份BDE-209，全部脱溴生成了BDE-206、207和208，而无其它含溴化合物的产生。从第II泥龄阶段后半段(31 d)开始，溴元素含量的实测值一直小于理论值，在第60 d，该差值达到197 μmol，占理论值的64.6%。此差值说明PBDEs厌氧降解生成了其它溴代化合物，可能是目标物以外的低溴代PBDEs同系物，也可能是非PBDEs的含溴化合物。对于这些潜在的降解产物，则需要利用同位素示踪技术和质谱技术、并结合可能降解途径进一步确定其结构。
3.5. 污泥中降解PBDEs厌氧菌的初步分析
为进一步确定厌氧消化过程中对PBDEs产生降解作用的细菌种类，我们分别采集不同反应阶段的污泥样品进行了微生物群落分析。样品共有四组，包括第0天污泥(接种污泥)、第20 d污泥(代表第I泥龄阶段)、第40 d污泥(代表第II泥龄阶段)和第60 d污泥(代表第III泥龄阶段)。
污泥样品中测定的物种有细菌和古细菌，共覆盖46门，其中厚壁菌门(Firmicutes)是最主要的门，在0 d、20 d、40 d和60 d污泥样品中的相对丰度分别为62.9%、61.7%、57.4%和59.3%。其次是变形菌门
Figure 2. The variation of Br derived from PBDEs during anaerobic digestion of sewage sludge
图2. 污泥厌氧消化过程中多溴联苯醚所含溴元素的变化
(Proteobacteria)，在四个污泥样品中所占比例分别为20.6%、18.4%、22.1%和17.3%，也处于优势地位。然后依次是放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、WS6门、浮霉菌门(Planctomycetes)、互养菌门(Synergistetes)、TM7门、拟杆菌门(Bacteroidetes)、OP9门、装甲菌门(Armatimonadetes)和广古菌门(Euryarchaeota)，相对丰度在0.1%到10%之间，余下各门相对丰度大都在0.1%以下。这与前期的研究结果类似 [25] [26] [27] 。例如：Chouari等 [25] 发现Firmicutes和Actinobacteria是厌氧消化污泥中主要的细菌门类，相对丰度为21.8%，其次为Chloroflexi (20.2%)、Bacteroidete (14.5%)和Proteobacteria (14.4%)。另外，OP10、WS3、OP8、TM6、OD1和C2等这些未培养的类群，也常在厌氧污泥中被检测到，且可作为潜在的门或纲 [27] 。
Chloroflexi门的厌氧绳菌纲(Anaerolineae)包含一些嗜热菌和中温菌，在厌氧污泥中常被检出 [28] 。前期研究表明，Chloroflexi中的脱卤球菌属(Dehalococcoides)具有还原脱卤作用，可以脱去PBDEs中的溴原子 [9] 。本研究中未检测到Dehalococcoides，但在60 d污泥样品中检测到了脱卤球菌科(Dehalococcoidaceae)，相对丰度为0.008%，其很有可能在PBDEs的降解中起到一定作用。且在厌氧消化过程中，Chloroflexi的相对丰度随时间不断增加，这可能加快污泥中PBDEs的降解。
本研究仅对污泥中可能降解PBDEs的菌种进行了探讨，未来的研究需要对单一菌种的脱溴机理展开研究，从实际污泥样品中分离、筛选和优化出有利于PBDEs降解的微生物优势菌种。
4. 结论
1) 中温污泥厌氧消化反应系统经过两个泥龄的运行，达到平衡状态。在整个反应过程中，BDE-209的质量呈现先上升后下降趋势，减少量约为19,600 μg，约占总质量的67.5%，表明在60天的厌氧消化过程中，污泥含有的BDE-209有67.5%发生了降解。其它PBDEs同系物呈现出不同的变化规律。在第I和III泥龄阶段，BDE-208和207的质量处于增加状态。对于BDE-203和196，在第I和II泥龄阶段均呈现减少现象，但绝对质量变化不大，在第III泥龄阶段开始增加。其余的PBDEs，包括BDE-206、183、153、138、99、47、28，其质量在整个消化反应过程中一直处于增加状态。
2) 三种九溴代同系物BDE-208、207和206质量的增加幅度较大，说明BDE-209首先脱溴生成九溴化合物。另外，BDE-206和207质量的增加量约为BDE-208的十倍，结合化合物分子结构，推断出BDE-209脱溴降解主要发生在邻位和间位溴原子上。
3) 通过16S rDNA高通量测序技术测定表明，污泥厌氧消化过程中微生物群落组成丰度较高，多样性较大。污泥样品中的细菌和古细菌共覆盖46门，其中厚壁菌门(Firmicutes)是最主要的门，其次是变形菌门(Proteobacteria)。Chloroflexi门的脱卤球菌科(Dehalococcoidaceae)，相对丰度虽然较低，但可能是降解PBDEs的重要菌种。
基金项目
本课题获国家自然科学基金(41172318)；国家水体污染控制与治理科技重大专项(2012ZX07313001)；新世纪优秀人才计划项目(NCET-12-0417)资助。