1. 引言
艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS，获得性免疫缺陷综合征)是由HIV (human immunodeficiency virus)感染所引起的一种免疫缺陷病。艾滋病于1981年被首次发现，我国在1985年报道首例病例。艾滋病在我国的传播可分为三个阶段：1985~1988年为第一阶段，为传入期或散发期，感染者主要为外来者，病例零星发现；1989~1994年是第二个阶段，为扩散期，此阶段感染率较低，6年内报道了1221例，疫情主要在局部地区流行；第三个阶段是1995年至今，艾滋病的发展进入了增长期或广泛流行期 [1] 。《2016年中国艾滋病防治进展报告》显示，2015年我国存活的艾滋病患者达到57.74万，其中新增患者为10.78万。
因为HIV病毒对于人体的免疫系统造成严重的破坏，不仅影响患者的劳动能力，而且大大降低了患者的寿命；此外，目前艾滋病者并没有治愈手段，需要长期服用药物抑制病毒扩增，给患者家庭和社会都带来沉重的经济负担。因此，艾滋病不仅是医学问题，也是严重的社会问题，给社会、经济、家庭和个人带来灾难性的结果 [2] 。
2. HIV感染
HIV病毒颗粒表面具有类似于细胞膜的膜结构。起吸附作用的糖蛋白穿透膜结构、通过与宿主细胞表面受体的结合而发挥作用。HIV病毒颗粒的核心由衣壳蛋白包裹，内部包含着HIV的遗传物质(两条RNA)和活性蛋白。
病毒的mRNA有三个开放读码框，分别为gag、pol和env多聚蛋白。gag蛋白翻译成熟为p24、p9和p17蛋白，它们组成HIV病毒颗粒的核衣壳。pol多聚蛋白成熟后分裂为蛋白酶、逆转录酶和整合酶。env多聚蛋白成熟为gp41和gp120蛋白，它们组成了HIV病毒的针形吸附糖蛋白结构。
与众多其他病毒类似，HIV病毒的扩增在宿主细胞中进行。在相当长的一段时间内，CD4被认为是HIV病毒唯一的受体。近期研究发现，趋化因子受体(CCR)发生缺失突变的HIV病毒感染者，其艾滋病病程发展较为迟缓；约有1%的高加索人因为携带δ32位置的突变而大大降低他们对于HIV的易感性，并且延缓了感染者发病进程。这些结果逐渐揭示了CD4受体附近的趋化因子受体也是HIV病毒入侵宿主细胞所必须的。
在人体中主要有CCR5 (一种β趋化因子受体)和CCR4 (一种α趋化因子受体)两种趋化因子受体涉及HIV的感染。在感染初期，病毒颗粒主要趋向于和CCR5结合，此类病毒体外扩增较慢，并不诱导合胞体的产生。在感染后期，病毒转变为合胞体诱导型，其主要识别的趋化因子受体为CCR4，这类病毒扩增病毒在体外的扩增速度较快。在HIV感染者体内，病毒数量巨大，通常既含有识别CCR4病毒也包含识别CCR5的病毒 [3] 。
当病毒颗粒通过CD4和趋化因子受体吸附在宿主细胞后，病毒的核衣壳及其内含物被注入宿主细胞内。在宿主细胞的胞浆中，病毒的逆转录酶以单链RNA为模板，合成双链DNA；双链DNA随后形成环形结构，并进入宿主细胞的细胞核中；在整合酶的作用下，病毒DNA整合进入宿主的基因组。
当HIV病毒的遗传信息整合进宿主的DNA中后，它将利用宿主细胞的转录和翻译机器，消耗宿主细胞氨基酸和能量，大量合成病毒扩增需要的糖蛋白和多聚蛋白。这些产物随后在病毒蛋白酶的作用下成熟为病毒外膜、核衣壳和活性蛋白的组成单元。结构单元组合产生大量的新HIV病毒颗粒。新病毒颗粒从宿主细胞中释放后将继续感染下一个宿主细胞。
HIV病毒是一种非常原始的病毒，其遗传物质在复制的过程中并不进行校正过程，这导致扩增产生的RNA与母体RNA相比，出现非常多的突变，而且突变的方向具有非常大的不确定性。高突变率在产生一些无活性病毒颗粒的同时，也为病毒颗粒适应环境中的各种应力(药物等)提供了可能性。同时，HIV的高扩增能力在一定程度上弥补了其遗传物质扩增时保真度低的缺点。据估计，一个艾滋病患者体内每天新生成约109个病毒颗粒 [4] 。
3. 艾滋病病程
机体感染HIV病毒以后，体内病毒扩增和免疫状态处于不断的变化，并导致患者表现不同的临床症状。根据这些参数，艾滋病的病程可分为四个阶段，分别为急性感染期、潜伏期、潜伏末期和艾滋病期。
AIDS病毒进入体内后，快速的扩增对宿主细胞CD4 T细胞造成严重的破坏，部分病人CD4细胞降低至100/mm3 [5] 。辅助淋巴细胞数量的急剧降低导致病人的免疫能力严重受损，并伴随着一系列症状。常见的症状有低烧、扁桃体炎、喉咙疼、皮疹、肌肉酸痛、头疼、持续腹泻、呕吐等。急性感染期持续时间一般为5~30天，最长可维持6个月之久。在急性感染期，高浓度的HIV病毒载量使得病人具有非常高的传染性，约有30%的传染发生在急性感染期。因此尽早的发现和诊断对于艾滋病的防治具有至关重要的作用 [6] 。
急性感染期后，病人的免疫系统开始发挥效应，产生针对AIDS的抗体，并对HIV病毒的扩增达到制约效果，将病毒的载量降至2000~6000拷贝/mL，这个时期称为潜伏期。潜伏期内HIV病毒载量越高，越容易导致患者的免疫机能衰退。统计数据显示，潜伏期内病毒载量超过100,000拷贝/mL时，患者在5年内发展为艾滋病期的概率将比病毒载量低的患者高10倍 [7] 。在潜伏期内，HIV病毒的扩增和患者免疫系统形成平衡状态，CD4细胞数目维持在正常生理范围之内，因此患者在此阶段无任何临床症状。一般而言，潜伏期可长达8~10年，大部分病人在这个阶段被确诊 [8] 。
潜伏期末期，HIV病毒与免疫系统的平衡逐渐被打破，HIV病毒载量逐渐上升并超过12,000拷贝/mL。与之对应，CD4淋巴细胞逐渐被破坏，其数目下降至正常生理水平下限500/mm3以下，这个阶段又称为艾滋病前期。在这个阶段，病人逐渐表现出艾滋病特异性的症状，包括：血细胞减少症、贫血症、嗜中性白细胞减少症、血小板减少症、牛皮癣、脂溢性皮炎、无菌性脑膜炎、顽固性头疼等。此外，很多患者在此阶段也表现出急性感染期中出现的诸多症状 [9] 。
HIV病毒的扩增持续对免疫系统造成破坏，当CD4细胞降至200个/mm3时，免疫功能受到极大的抑制，患者容易被各种机会性感染影响并出现以下并发症：痴呆，食管、气管、支气管、肺部真菌感染，腺病毒感染，单纯孢疹病毒感染，真菌感染，宫颈癌，卡波氏肉瘤，肺炎等。这个阶段，病人进入艾滋病期，各种并发症逐渐威胁到患者的生命 [9] 。
CD4+细胞的检测
如前所述，CD4淋巴细胞是HIV病毒的主要宿主细胞，也是HIV病毒抑制免疫系统活性的靶点。因此，CD4细胞数目与艾滋病病程密切相关，所以监测CD4细胞具有非常重要的临床意义。CD4细胞的检测可用于：筛查HIV感染者，特别是急性感染期的患者；根据CD4的绝对计数或者百分比计数对感染者进行分期；辅助判断ART用药时机；评价抗病毒药物的有效性。
目前市场上CD4细胞计数的产品种类繁多，其中大部分产品是基于流式细胞术开发的。流式细胞术也是CD4阳性T细胞计数的金标准方法 [10] 。
流式细胞术是一种结合了细胞生物学、流体力学、光学、电学等多种学科的临床检测技术。其原理是采用荧光分子偶联的单克隆抗体标记细胞表面或者细胞内部的目标分子，当单个悬浮细胞流过流动室时被激光激发并发射出相应的荧光信号，流式细胞仪的光学系统和电子系统对荧光信号进行收集、转化、分子、整合，最终完成对样本信号的采集和分析。流式细胞术的优点在于可以快速的单个细胞进行信号分子检测、以获取细胞整体的信息。在CD4阳性T细胞计数中，通常将荧光分子标记CD4抗体与其他表面抗原(CD45、CD3等)抗体联用，对CD4细胞进行染色识别，然后完成细胞的计数。
流式细胞术对CD4细胞计数，有双平台和单平台两种模式。双平台法涉及血细胞分析仪和流式细胞仪两个平台的综合应用：利用血细胞分析仪得到淋巴细胞或者白细胞的数量，通过流式细胞仪得到CD4细胞在淋巴细胞或者白细胞中的占比，再将两个结果相乘得到CD4细胞的浓度 [11] 。此方法因为涉及两个计数平台，增加了误差源，准确性质控难度较高；同时，血细胞计数仪和流式细胞仪的操作难度大，仪器成本高，不适用于经济落后的区域。目前临床较少采用此方法。
相对于双平台法，单平台法有诸多方面的优势：仅涉及单种仪器，减少了计数操作的复杂程度；减少引入误差机会、提高结果的准确性和可重复性；同时，此方法还大大降低报告结果的时间，提高临床检验的时效性。单平台方法中，一种方式是通过向临床样本中加入已知浓度的荧光微球以实现CD4细胞计数，BD的TruCount和Beckman coulter的PLG-CD4试剂均采用这一原理 [12] 。此方法因进入市场较早，在临床检验和疾病研究中都被广泛采用。但其缺点在微球的加入增加了耗材的成本，而且检测者在添加微球过程中极易引入误差，降低检测的准确性和可重复性；另一种方式则在计数过程中 同时准确测量血液样本体积，将CD4计数结果除于样本体积以获得CD4细胞浓度，规避了对微球的需求，迈瑞的Bright E6系统则利用了这一原理。
4. 展望
艾滋病对于患者的免疫系统造成严重损伤，艾滋病并发症极大的影响患者的生活质量，并造成非常高的死亡率。因此艾滋病的诊断和治疗逐渐引起越来越多的关注。
CD4淋巴细胞是HIV病毒的主要靶细胞。CD4细胞的绝对数量与患者体内的HIV病毒载量密切相关，所以对CD4细胞进行绝对计数具有重要的临床意义。根据患者CD4细胞浓度，可以筛查患者、对患者进行分析、辅助判断用药试剂、评估药效等。
目前，CD4细胞计数有双平台法和单平台法。双平台法因涉及血细胞分析仪和流式细胞仪，操作难度高，目前临床应用较少。单平台法中，BD的Trucount和Beckman Coulter的PLG-CD4采用荧光磁珠辅助细胞计数。但各自都有一定的缺点，Trucount的成本非常高，不适用于贫困地区的推广和使用；PLG-CD4中采用检验者添加荧光微球，导致增加了误差引入过程，影响结果准确性。迈瑞新开发的流式细胞仪采用测量样本体积的方式计算CD4细胞浓度，操作相对简单易行，具有非常大的优势。此方法的推广可有力的推动临床CD4细胞计数工作的开展。