摘要:
目的：分析自然流产的绒毛染色体情况，探讨绒毛细胞染色体异常与孕早期自然流产间的临床关系。方法：收集499例妊娠早期自然流产患者的绒毛组织，采用Array-CGH进行核型分析，分析流产绒毛染色体异常情况。结果：本组499例绒毛组织均成功获得Array-CGH检查结果，检测成功率100.0%。Array-CGH检出染色体异常251例，异常率50.30% (251/499)，包括单条染色体数目异常211例(84.06%)，两条染色体数目异常14例(5.58%)，三倍体1例(0.40%)，缺失或重复25例(9.96%)。结论：胚胎染色体异常是早期自然流产的重要原因，Array-CGH检测方法分辨率高、准确快速，是诊断流产组织遗传学的可靠方法，具有较高的临床应用价值。
Abstract:
Objectives: To analyze the chromosome of chorionic villus in spontaneous abortion, and to explore the relationship between chromosomal abnormalities of villus cells and spontaneous abortion in early pregnancy. Methods: The villus tissues of 499 cases of spontaneous abortion in early preg-nancy were collected, and karyotype analysis was performed by Array-CGH. Results: 499 cases of villus were successfully obtained array-CGH examination results, and the detection success rate was 100.0%. 251 cases of chromosomal abnormalities were detected by array-CGH, and the abnormal rate was 50.30% (251/499), including 211 cases (84.06%) of single chromosome number abnormality, 14 cases (5.58%) of two chromosomes, 1 case (0.40%) of triploid and 25 cases (9.96%) of deletion or repetition. Conclusion: Fetal chromosomal abnormality is an important cause of early spontaneous abortion. The array-CGH detection method is high resolution, accurate and rapid. It is a reliable method to diagnose the genetics of abortion and has high clinical value.
1. 引言
近几年来，孕妇流产不断呈现上升趋势，流产不仅给患者造成精神上的痛苦，也给家庭带来极大的不安定因素。自然流产的病因很多，如染色体异常、TORCH感染、精子异常、激素水平不足等，甚至精神压力过大、环境因素、母体的不良习惯都会造成流产 [1] [2] ，其中由于胚胎基因或染色体异常引起的流产一般认为可占自然流产病例的50%以上 [3] 。绒毛细胞是胚胎外胚层细胞，具有与胚胎组织一样的遗传性状，是检测胎儿染色体异常的主要标本 [4] 。我们采用微阵列比较基因组杂交技术(array-based comparative genomic hybridization, array-CGH)对499例自然流产的绒毛染色体进行了分析及总结，旨在探讨绒毛细胞染色体异常与孕早期自然流产间的临床关系，现报告如下。
2. 资料与方法
2.1. 病例选择
选取2016年1月~2016年12月在山东大学附属生殖医院就诊诊断为妊娠早期自然流产的499例孕妇作为研究对象，孕妇年龄22~45岁，平均年龄(32.04 ± 4.97)岁，孕周6~12 w，平均(9.65 ± 2.13)周，不区分孕次胎次，经B超检查证实为宫内妊娠，可见孕囊但不能见心管搏动；排除感染、有害物质接触史、停经时间 ≥ 13 w、近期有性生活等因素。本课题研究提交山东大学附属生殖医院伦理委员会审核通过，所有入组患者均签署知情同意书。
2.2. 方法
2.2.1. 自然流产组织的采集
采用手术治疗的孕妇，通过负压吸引术收集绒毛组织，组织经无菌生理盐水清洗后送检，吸引时负压最高不超过500 mmHg，术者均经过专业培训；采用药物治疗的孕妇，通过联合服用米非司酮及米索前列醇排出绒毛组织，无菌生理盐水清洗后送检，药物服用均经过医师指导，口服米索前列醇后住院留观，标本采集由医护人员完成。两种治疗方式由患者自主选择，医师完善相关辅助检查并排除相应禁忌后应用。
2.2.2. 标本处理
无菌条件下，用无菌生理盐水反复冲洗绒毛组织，去除红细胞及蜕膜组织；然后吸净生理盐水，置于解剖显微镜下挑取分芽多、末端粗钝、呈鹿角状的优质绒毛组织，小心剪取15~20 mg，置于无菌盐水中，待检。
2.2.3. Array-CGH检测方法
1) 采用德国QIAGEN公司QIAamp DNA mini Kit提取绒毛组织DNA；2) 采用Cy3/Cy5标记DNA，37℃孵育16~20 h后用Autoseq G50柱纯化；3) 标记后的待检DNA与对照DNA等量混合、浓缩，将标记好的DNA溶液点至盖玻片上，再将芯片盖上，置于杂交盒内，47℃孵育16~21 h (按照Array CGH Constitutional Focus标准流程操作)；4) 芯片洗涤甩干后采用InnoScan900扫描仪扫描芯片，保存图像；5) 使用BlueFuseMuti对扫描图像进行分析，得到标本的分子核型。
3. 结果
3.1. 染色体异常检出率
本组499例绒毛组织均成功获得array-CGH检查结果，检测成功率100.0%。array-CGH检出染色体异常251例，异常率50.30% (251/499)，其中，单条染色体数目异常211例(84.06%, 211/251)，两条染色体数目异常14例(5.58%, 14/251)，三倍体1例(0.40%, 1/251)，缺失或重复25例(单一位点缺失或重复19例，两个位点缺失或重复6例)，占9.96% (25/251)，具体分类见表1。
3.2. 单条染色体非整倍体异常检出情况
211例单条染色体数目异常病例共179例三体(其中包括2例嵌合体)分布于除1号与12号染色体外的其他染色体中，其中以16号染色体和22号染色体三体最多，分别为52例(24.64%)和22例(10.43%)；单体以性染色体单体最多，为23例(包含2例嵌合单体)，还发现3例21号染色体单体、3例19号染色体单体(包含2例嵌合单体)，分布见图1。
Figure 1. Abnormal distribution of aneuploid of single chromosome
图1. 单条染色体非整倍体异常分布
Table 1. Classification of abnormal results detected by Array-CGH in 499 cases
表1. 499例流产物绒毛Array-CGH检出异常结果分类
3.3. 两条染色体非整倍体异常
本组发现两条染色体数目异常14例，其中两条常染色体三体11例、8号染色体三体并性染色体嵌合单体1例、8号染色体嵌合三体并性染色体嵌合单体1例、22号染色体三体并Y染色体缺失1例。
3.4. 单一位点缺失或重复染色体检出情况
19例单一位点缺失或重复样本中，14例为缺失，其中性染色体缺失3例，4号、18号和22号各缺失2例，1号、2号、5号、9号和19号各缺失1例；5例重复中，5号、6号、15号、16号和Y染色体各有1例。
3.5. 两个位点缺失或重复染色体检出情况
6例两个位点缺失或重复染色体样本中有4例表现为一条染色体重复、另一条染色体缺失；1例表现为两条染色体均重复；1例为1号染色体短臂缺失但长臂重复，核型为−1 (p36.21-pter)；+1 (q42.3-qter)。
4. 讨论
自然流产是妊娠期最普遍的并发症之一，且多数为妊娠12周前的早期流产。自然流产发生的原因很多，主要有遗传、免疫、内分泌、子宫病变、环境诱发等，其中遗传因素是导致自然流产的最重要原因，而在引起自然流产的遗传因素中，胚胎染色体异常又是最常见的 [5] 。因此，检测分析流产胚胎组织的染色体，有助于明确流产的原因，为再次妊娠的风险评估提供依据。
目前，自然流产的遗传学诊断的“金标准”是常规绒毛培养染色体核型分析法，但该技术有明显的局限性，如细胞培养耗时长、标本取材要求高、培养失败率高、易污染、分析过程复杂、重复性差、对嵌合体的诊断不精确及无法检测染色体的微缺失等 [6] 。荧光原位杂交(FISH)技术是近年来以分子生物学为基础飞速发展起来的一项自动化新技术，具有快速方便、无需细胞培养、敏感性高、特异性强等优势 [7] 。但绒毛染色体FISH检测所用试剂盒的探针不能涵盖所有的染色体，只是针对样本中13/16/18/21/22/X/Y染色体数目异常，因此对于这7条染色体之外的其它染色体数目异常及所有染色体结构异常不能检测 [8] 。array-CGH技术是新近发展起来的一种高效分子核型分析技术，其优势在于避开中期染色体，直接在DNA水平上进行诊断及分析，可得到高分辨率的全染色体基因拷贝数的分布 [9] ；同时，由于探针在基因组上的定位是已知的，故array-CGH能直接将检测到的基因组拷贝数变异在基因组上定位，从而精确的描述染色体畸形及定位 [10] ；此外，由于array-CGH不需要细胞培养，检测周期明显缩短。本研究采用array-CGH技术对499例自然流产的绒毛染色体进行了分析及总结，结果显示， 499例绒毛组织均成功获得array-CGH检查结果，检测成功率100.0%；array-CGH检出染色体异常251例，异常率50.30%，包括单条染色体数目异常211例，两条染色体数目异常14例，三倍体1例，缺失或重复25例。
综上所述，胚胎染色体异常是早期自然流产的重要原因，对流产组织进行染色体检测可为病因诊断及指导优生提供依据。array-CGH检测方法分辨率高、准确快速，是诊断流产组织遗传学的可靠方法，具有较高的临床应用价值。
NOTES
*通讯作者。