1. 引言
鼻咽癌最常见于中国南方，其中，广西发病率位居全国第二。由于鼻咽癌位置的隐蔽性和临床症状的多样性，大多数患者就诊时已属中晚期。经过合理的放射治疗和规范的综合治疗后，远处转移是鼻咽癌治疗失败的主要原因之一 [1]。因此对鼻咽癌转移机制的研究非常重要，它是进一步降低鼻咽癌转移率、提高患者生存质量的关键步骤。
水通道蛋白1 (Aquaporin 1, AQP1)是水通道蛋白家族的一员，近年来研究发现它与肿瘤的浸润转移有重要联系 [2] [3] [4]。为明确AQP1在鼻咽癌转移中的作用，本研究通过RT-PCR法在RNA水平和Western blot法在蛋白水平检测AQP1在3种不同转移潜能人鼻咽癌细胞株CNE-1 (中度转移性)、CNE-2 (高转移性)、5-8F (极高转移性) mRNA表达及蛋白表达的差异，分析AQP1表达与人鼻咽癌细胞转移潜能的相关性，为进一步研究AQP1与鼻咽癌浸润转移实验提供理论基础，争取在明确鼻咽癌转移机制上提供分子生物学基础。
2. 材料与方法
2.1. 材料
3株不同转移潜能的人鼻咽癌细胞株(CNE1、CNE2、5-8F)中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心和武汉普诺赛生命科技有限公司，培养条件为含10%小牛血清及青、链霉素的RPMI1640培养基(BioInd公司)，5% CO2孵箱37℃孵育。
2.2. 实验方法
2.2.1. RT-PCR 检测鼻咽癌细胞中AQP1mRNA表达水平
AQP1 mRNA引物：上游引物5’-CAGCCCAAGGACAGTTCAGAG-3’，下游引物 5’-CCATCATGGCTAAGTGCACAG-3’，扩增片断长度为119 bp。内对照β-actin引物：上游引物5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’，下游引物5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGGA-3’，扩增片断长度为185 bp。对数期细胞，按照Trizol试剂盒说明提取总RNA，每份细胞总RNA经逆转录成cDNA模板链后，取2 μL cDNA模板配置25 μL PCR反应体系，震荡混匀后短暂离心，置于PCR扩增仪中扩增。用微量移液器将sybr green荧光染料1 μL、扩增后DNA样品5 μL和DNAMaker 5 μL混匀后再缓慢加到电泳槽内，接通电源，当样品各条带已跑到预期位置，切断电源。紫外照相并进行分析扫描。AQP1 mRNA表达的相对值为各目的基因与β-actin产物条带的灰度值比值。
2.2.2. Western Blot法检测3种细胞株中AQP1蛋白表达
取对数期细胞，裂解离心得到总蛋白，采用bradford比色法测定蛋白含量。SDS PAGE电泳分离40 μL样本，利用电转印法使蛋白转移至PvDF膜上，4℃封闭过夜后加入一抗孵育2 h，TBST洗涤3次后加入辣根过氧化物酶标记的二抗进行孵育(37℃, 1 h)，孵育结束后TBST再次洗涤3次，最后曝光显影。AQP1蛋白相对表达量为各目的蛋白光密度值与相应内参β-actin光密度值的比值。
1.3统计学方法采用SPSS 20.0软件进行分析，应用单因素方差分析和LSD法，P < 0.05为差异有统计学意义。
3. 结果
3.1. 不同人鼻咽癌细胞株中AQP1 mRNA的表达水平
RT-PCR结果显示AQP1 mRNA 在CNE1、CNE2、5-8F三种不同转移潜能鼻咽癌细胞株中的相对表达量有统计学差异(P < 0. 05)。两两比较结果显示，CNE-2、5-8F两组表达水平差异虽无统计学意义(P = 0.125)，但均高于CNE-1 (P均 < 0.05) (见表1)。
Table 1. Expression of AQP1 mRNA in 3 nasopharyngeal carcinomacell lines
表1. 三种鼻咽癌细胞株中AQP1 mRNA的表达
3.2. 不同人鼻咽癌细胞株中AQP1蛋白的表达水平
Western blot 结果显示在CNE-1、CNE-2及5-8F细胞株中均可检测到AQP1蛋白的表达(见图1)。方
Figure 1. Expression of AQP1 protein in CNE2, CNE1 and 5-8F cell lines dectecting by Western blot
图1. Western blot检测鼻咽癌瘤株CNE2、CNE1、5-8F细胞中AQP1的表达
Table 2. Expression of AQP1 protein in 3 nasopharyngeal carcinomacell lines
表2. 三种鼻咽癌细胞株中AQP1的表达
差分析和两两比较结果显示，三种细胞株AQP1蛋白表达均有统计学差异(P均 < 0.05)，其中5-8F最高，其次为CNE-2，CNE-1表达最低见(表2)。
4. 讨论
本研究中，我们发现AQPl在不同转移潜能鼻咽癌细胞株中的表达有差异，高转移性的鼻咽癌细胞株CNE2、5-8F的AQP1表达高于相对低转移性的细胞株CNE-1，其中5-8F表达最高，CNE-2次之，提示AQPl与鼻咽癌的转移有密切的关系。
水通道蛋白广泛存在于原核和真核生物细胞膜，能高效、选择性的转运水分子，对调节动、植物的水代谢起着重要作用 [5]。AQP1是最早发现的水通道蛋白，其基因定位于人染色体7p15 → p14 [6] ，质膜中以四聚体形式存在，在4个单体的中心部分含有独立的孔道，孔道中有1个带正电的区域会排斥带正电的离子，避免水合质子的通过。AQP1是一种高效运输水的通道，其介导的水被动跨膜转运，在维持细胞内环境的稳定平衡中起着特殊作用。近年来发现，AQP1在肿瘤的转移过程中主要发挥以下两点作用：1) 促进肿瘤血管生成。恶性肿瘤内AQPl表达水平和微血管密度呈正相关 [7] ，敲除AQPl基因的小鼠成瘤能力大大降低，肿瘤细胞生长显著减缓，血管生成减少 [8]。2) 促进肿瘤细胞迁移。AQP1可以通过促进边缘细胞膜突起物的更新来加速细胞迁移，提示由AQP1介导的跨膜水转运可能在肿瘤细胞迁移过程中发挥了重要的作用，即促进细胞形状改变和帮助细胞向前推进 [9]。
目前，AQP1在鼻咽癌侵袭转移的研究较少。李琦研究结果发现鼻咽肿瘤组织中AQP1表达强于非肿瘤组织，且发生转移的肿瘤组织中表达进一步升高 [10] ；AQP1在鼻咽癌中通过VEGF参与血管生成,从而促进肿瘤生长和转移 [11]。本研究在鼻咽癌细胞水平指出，AQP1在不同侵袭潜能鼻咽癌细胞株中的表达有差异，也进一步证实了AQP1与鼻咽癌转移的相关性。
5. 结论
综上所述，AQP1上调表达可能促进鼻咽癌的浸润转移，有望成为评估鼻咽癌患者预后的指标，并指导临床治疗方案的选择。抑制AQPl表达，能否逆转鼻咽癌细胞侵袭性，降低鼻咽癌转移率，值得进一步研究。
基金项目
广西高校中青年教师基础能力提升项目(2017KY0129)。
NOTES
*通讯作者。