微RNA在脑缺血/再灌注损伤中作用的研究进展

Research Progress on Effects of MicroRNA in Cerebral Ischemia/Reperfusion Injury

摘要: 脑缺血/再灌注损伤(cerebral ischemia/reperfusion injury, CIRI)是脑缺血患者恢复血流灌注时常见的病理生理现象，其发病机制涉及多个环节，主要与能量代谢障碍、Ca2+超载、氧化应激、炎症反应等机制有关。微小核糖核酸(miRNA)是一种近年来发现的存在于真核生物中的非编码调控RNA，其作用机制主要是在转录后水平上调控基因的表达。近期研究发现，相关miRNAs参与CIRI的发生发展过程。本文将概述CIRI发病机制，综述相关miRNAs调控CIRI进程的作用，为CIRI的防治提供新的靶点和思路。

Abstract: Cerebral ischemia/reperfusion injury (CIRI) is a common pathophysiological phenomenon in the recovery of blood flow in patients with cerebral ischemia. The pathogenesis involves multiple pathways, mainly related to energy metabolism disorder, Ca2+ overload, oxidative stress, inflammatory reaction and so on. MicroRNA is a small non-coding regulation RNA in eukaryotes found in recent years. Its mechanism is mainly regulation of gene expression after transcription. Recent studies have found that related miRNAs are involved in the development of CIRI. This paper mainly reviews the pathogenesis of CIRI, describes the role of related miRNAs in the regulation of CIRI, and provides new targets and ideas for the prevention and treatment of CIRI.

1. 引言

缺血性脑血管病是临床多见的脑血管疾病，约占全部脑血管病人的70%~80%，使缺血脑组织尽早恢复血液灌注，重新获得血氧供应是临床上的首要治疗原则。但闭塞的脑血管再通后，往往加重原有缺血脑组织损伤，这种现象被称为脑缺血/再灌注损伤(cerebral ischemia/reperfusion injury, CIRI) [1]。微小核糖核酸(miRNA)是一类长约21~22个核苷酸的小非编码RNA，可以结合靶信使RNA (mRNA)的3’-非翻译区(UTR)，并在转录后水平对基因的表达进行负调控 [2]。据估计，miRNA调控人类30%以上的基因编码 [3]，目前miRNA对mRNA的具体调控机制尚不完全清楚，但miRNA能够通过特定机制对mRNA特定靶点的沉默作用在细胞和组织中调控基因的表达。研究表明 [4]，CIRI时，多种miRNAs的表达发生变化，并通过改变关键信号元件调控CIRI的病理生理过程。本文对CIRI机制及miRNAs在调控CIRI中的作用作阐述。

2. CIRI的病理生理机制

2.1. 氧化应激

氧化应激(Oxidative Stress, OS)是指体内氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素 [5]。CIRI后，活性氧簇(ROS)的产生与清除之间的平衡被打破，造成ROS过度产生，从而导致氧化应激诱导细胞损伤。研究发现 [6]：ROS的过度产生，会导致：① 蛋白质、核酸过氧化，蛋白质降解、核酸断裂，膜结构破坏；② 血管内皮细胞严重受损，血管通透性增加；③ 兴奋性氨基酸在突触间隙内含量明显增加；④ 破坏线粒体，导致能量生成障碍；⑤ 产生血栓素A2使缺血区血管痉挛，血小板聚集，加大梗死面积；⑥ 介导炎症反应和免疫反应等。

2.2. 能量代谢障碍

脑血流供应丰富，当脑缺血时，血流量减少，缺血区脑组织血氧供应减少，只能通过糖的无氧酵解获得能量，而无氧酵解途径ATP产生减少，导致脑组织代谢需要的营养物质缺乏，线粒体及其他细胞器受损，进一步加重缺血区域脑组织损伤 [7]。脑缺血再灌注后，ATP产生不足，钠钾泵活性下降，导致细胞内Na⁺浓度增高引起细胞毒性脑水肿，造成神经损伤 [1]。另外，脑缺血再灌注期间，细胞内钙超载、自由基和游离脂肪酸的大量生成以及兴奋性氨基酸的释放均可引起线粒体通透性转换通道开放，造成线粒体能量合成障碍，导致神经元死亡。

缺氧缺血情况下，线粒体DNA受损，使呼吸链复合物电子传递完整性受到破坏，主要是呼吸链复合物活性受损，使黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性复合物途径被过度利用，自由基生成增加，超过了细胞本身的清除能力，导致细胞凋亡，因此线粒体DNA的表达紊乱可引起能量产生进行性衰竭，导致细胞死亡 [8]。

2.3. Ca²⁺超载

Ca²⁺是细胞生命过程中的一个重要元素，正常情况下，由于细胞膜对Ca²⁺的低通透性和钙泵作用，使得细胞外Ca²⁺浓度是细胞内的10,000倍。脑缺血缺氧后，细胞内Ca²⁺浓度明显升高，引起细胞损伤即Ca²⁺超载 [9]。Ca²⁺超载是各种原因综合的结果。Ca²⁺在CIRI中主要作用表现在以下几点：首先，它通过激活多种Ca²⁺依赖酶，包括蛋白激酶C、磷脂酶A2、磷脂酶C、环氧合酶、钙依赖型一氧化氮合酶、钙蛋白酶和各种蛋白酶和内切酶，导致多种损伤事件 [10]。其次，当发生CIRI时，细胞外大量的Ca²⁺涌入细胞内，触发线粒体摄取Ca²⁺，使Ca²⁺聚集在线粒体内，Ca²⁺可抑制ATP合成，使能量生成障碍 [11]。

2.4. 炎症反应

近年研究结果表明 [12]，造成CIRI的重要原因之一为脑缺血局部组织再灌注后的炎性反应。炎性反应过程中有许多炎性介质和炎性细胞的参与，炎性细胞浸润后可产生细胞因子、趋化因子和黏附分子等大量的炎性介质。参与大脑炎症反应的炎性介质有很多，其中主要包括细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素(IL)等。

在CIRI的过程中，肿瘤坏死因子-α (TNF-α)发挥着重要作用。脑缺血发生后，TNF-α表达即升高，再灌注后，TNF-α的特异性受体表达明显升高。有报道称，如果抑制TNF-α表达，可减轻缺血性脑损伤 [13]。TNF-α使毛细血管通透性增加，促进脑水肿的发生，导致细胞凋亡和坏死。中枢神经系统内，几乎所有的细胞都能合成IL-1β，脑缺血再灌注时，IL-1β含量明显升高，使得细胞内Ca²⁺升高，引起脑细胞损伤；使得谷氨酸水平升高，加重CIRI。

2.5. 细胞凋亡

脑缺血缺氧发生后，脑缺血半暗带的细胞损伤主要通过细胞凋亡途径进行，因此神经细胞凋亡是CIRI的重要环节。神经元凋亡主要有三种途径：① 线粒体介导细胞凋亡。线粒体是一个储存器，储存了多种促凋亡蛋白，当脑缺血发生时，促凋亡蛋白释放到胞浆，与凋亡蛋白激活因子形成复合体，激活Caspase9，引起连锁反应，使细胞凋亡 [14]。② 死亡受体介导细胞凋亡。死亡受体是一类跨膜蛋白，其胞外和胞质区各有一段富含同源半胱氨酸的区域，有水解蛋白的功能，称为“死亡结构域”。典型的死亡受体包括Fas和TNFR1。Fas的死亡结构域和Fas相关蛋白(FADD)结合，启动caspase级联反应，导致细胞凋亡 [15]。TNFR1通过和TNF-α受体死亡结构域(TRADD)结合，导致caspase级联反应诱导细胞凋亡。③ 内质网介导细胞凋亡。内质网是细胞内Ca²⁺的主要储存库，通过对Ca²⁺浓度的精确调控影响细胞凋亡，同时，相对高浓度的Ca²⁺可以激活钙依赖性蛋白酶，作用于线粒体，影响通透性和膜电位，促进凋亡。

3. miRNAs调控CIRI进程

在CIRI的病理生理过程中，相关miRNAs表达发生变化。Yuan和他的同事通过建立大鼠脑缺血20 min后再灌注30 min或24 h的模型，来观察在大鼠海马中miRNAs的表达谱，结果发现缺血再灌注30 min后，23种miRNA上调，32种下调；再灌注24 h后，40种miRNA上调，31种下调 [16]，这些变化的miRNAs可能参与了CIRI。在国内的其他研究中发现，多种变化的miRNAs通过影响不同的信号通路，调控CIRI的进程。

3.1. miRNAs调控氧化应激

在不同组织和细胞的各种生物过程中，一些miRNAs通过调节ROS的水平，影响目的基因的表达，在细胞氧化还原反应中起着关键作用 [17] [18]。在CIRI过程中，这些miRNAs的表达发生改变，调控的ROS也发生改变。同时，相关研究证实这些miRNAs通过调控氧化应激在CIRI中发挥作用。蛋白激酶CK2是在哺乳动物细胞中普遍存在的丝氨酸–苏氨酸激酶。CK2由三个不同的亚基组成：α，α’和β。据报道CK2α通过负调节NADPH氧化酶在CIRI中发挥神经保护作用 [19]。NADPH氧化酶是在缺血期间产生有害的氧衍生自由基的主要因素。Liang [20] 等建立细胞氧糖剥夺/复氧(OGD/R)模型模拟CIRI，发现miR-125 b水平升高，CK2α表达降低。使用miR-125b抑制剂下调miR-125b的表达，解除对CK2α的抑制，使NADPH氧化酶的作用效果降低，减轻氧化应激，减少细胞凋亡。BTB和CNC同源性1 (Bach1)是一个转录因子，通过干扰核因子红系2相关因子2/抗氧化反应元件(Nrf2/ARE)信号传导途径参与调节各种刺激下的氧化应激 [21] [22]。Sun [23] 等通过荧光素酶报告试验发现Bach1是miR-98-5p调控的下游基因，建立细胞OGD/R模型模拟CIRI，发现miR-98-5p表达降低，Bach1表达提高。使用miR-98-5p的激动剂使miR-98-5p的表达增加后发现，Bach1表达减低，Nrf2的核表达量增加，ARE的活性提高，减轻了OGD/R诱导的神经元凋亡和ROS的产生。以上这些miRNAs均通过调控氧化应激在CIRI中发挥作用。

3.2. miRNAs调控能量代谢

在脑缺血再灌注损伤中，miRNAs通过调控线粒体的功能进而影响能量代谢 [24]。在缺氧过程中，葡萄糖、ATP和磷酸肌酸水平降低，miRNAs可以调节ATP的生成或向ADP的转化，使ADP/ATP比例增高，导致脑组织代谢所需要的营养物质缺乏，进一步加重脑组织损伤。例如，细胞色素c氧化酶IV (COXIV)是线粒体电子传递链的关键蛋白，参与ATP的生产，COXIV水平的变化会影响线粒体功能。miR-338通过调节COXIV的表达，并且靶向编码重要蛋白的多种线粒体mRNA来参与氧化磷酸化，进而影响能量代谢 [25]。ADP-核糖基化因子样2(Arl2)定位于腺嘌呤核苷酸转运蛋白1，是线粒体中ADP/ATP的交换器。miR-15b通过靶向Arl2调节ATP的浓度，过表达miR-15b将下调Arl2表达，从而抑制ADP/ATP交换和ATP合成 [26]。免疫磷酸转运蛋白载体家族25成员3蛋白(slc25a3)是ATP的产生是必不可少的跨膜蛋白，miR-141通过调节slc25a3的表达，并影响线粒体ATP的产生。这些miRNAs均通过调控线粒体的功能来影响ATP的生成在CIRI中发挥作用。

3.3. miRNAs与Ca²⁺超载

缺血/再灌注时，Ca²⁺超载是各种因素综合作用的结果，也是造成脑缺血损伤过程中各种因素作用的共同通路。Li [27] 等研究发现，miR-202-5p通过减轻心肌细胞Ca²⁺超载，防止线粒体功能紊乱，保护心肌细胞免受缺血再灌注损伤。改善心肌细胞的钙稳态和线粒体功能，并保留心肌细胞的功能和结构，对正常大鼠的心肌缺血再灌注损伤有保护作用，改善心功能。Cha [28] 等研究发现，miR-145的过表达在氧化应激下通过下调钙/钙调素依赖性蛋白激酶II (CaMKII)来保护心肌细胞中的Ca²⁺超载，进而减少心肌细胞的凋亡。而miRNAs与CIRI中Ca²⁺超载相关的机制还有待研究。

3.4. miRNAs与炎症反应

CIRI后，局部浸润的炎性细胞产生大量炎性介质，是CIRI过程中重要环节。白细胞介素(IL)-1受体相关激酶4 (IRAK 4)是参与天然免疫应答过程的关键分子 [29]，在由Toll样受体(TLRs)/IL-1受体(IL-1R)介导的炎症信号通路中发挥作用 [30] [31]。Tian [32] 等发现，CIRI小鼠脑中miR-93的表达水平明显降低，减少了对IRAK 4的抑制，增加促炎症因子的表达，产生炎症反应。通过转染上调miR-93，负性调节IRAK 4在CIRT中发挥抗炎作用，减少炎症反应，产生保护作用。Nurr1 (NR4A2)是核受体4家族的孤儿核受体的成员，研究显示Nurr1通过与小胶质细胞中靶炎症基因启动子的NF-κB-p65对接来抑制促炎性神经毒性介质的表达 [33] [34]。Xie [35] 等通过建立大鼠脑缺血/再灌注模型发现miR-145-5p表达升高，Nurr1的表达降低，并通过双荧光素酶实验得出miR-145-5p负性调节Nurr1。通过miR-145-5p过表达，导致Nurr1介导的TNF-α表达升高，加速了大鼠的炎性损伤。这些miRNAs通过作用于炎性介质IL-1或TNF-α产生炎症反应，造成CIRI。

3.5. miRNAs与自噬

自噬是一种高度保守的分解代谢途径，通过降解异常蛋白和受损细胞器去除不利于细胞存活的因素，并将降解所产生的物质循环利用于细胞更新修复，以维持细胞内环境的稳态 [36]。在轻度CIRI时，自噬大多被适度激活并起到神经保护作用。自噬的过程需要自噬相关基因的参与，其中自噬特征蛋白Beclin-1和自噬体膜上的标志性蛋白微管相关蛋白轻链(LC3)对于自噬的检测具有重要意义 [37]。SIRT1具有神经保护作用，也是许多疾病中的自噬介质。Tian [38] 等建立OGD/R模型模拟CIRI发现，miR-138表达下调，SIRT1表达上调。通过双荧光素酶基因报告法证明SIRT1可能是miR-138调控的下游靶点。敲除miR-138后发现，SIRT1表达显著升高，Beclin-1和LC3的蛋白水平显著升高，促进细胞自噬，发挥保护作用(p < 0.05)。核因子-κB激活剂(Act)1是E3泛素连接酶，参与细胞自噬通路的调节。Sun [39] 等建立大鼠CIRI模型发现miR-298下调，Act1上调，细胞存活率升高。通过转染上调miR-298的表达，加强对Act1的抑制，减少自噬相关蛋白的表达，诱导细胞凋亡，加重脑损伤。这些miRNAs均通过作用于自噬相关基因来激活自噬，在CIRI中发挥保护作用。

3.6. miRNAs调控凋亡相关通路

在CIRI损伤中，miRNAs通过影响凋亡相关基因进而调控细胞凋亡通路。Bcl-2蛋白家族、Caspase家族、Fas基因和p53基因等许多凋亡相关基因均参与了细胞凋亡过程 [40] [41]。Bcl-2样蛋白14 (Bcl-G)属于Bcl-2家族的一个成员，是最早被描述为促凋亡的因子 [42]。Yao [43] 等通过线栓法建立大鼠脑缺血再灌注模型发现，miR-496表达下调，Bcl-G表达上调。通过转染使miR-496过表达，增加了对Bcl-G的抑制作用，减轻细胞的损伤。Sirtuin 1 (SIRT1)是一种依赖于NAD⁺的组蛋白脱乙酰基酶，它是沉默信息调节因子SIR2中哺乳动物同源基因中的最高因子 [44]。研究发现 [45]，SIRT1具有神经保护作用。Lu [46] 等发现在大鼠脑缺血再灌注模型中，SIRT1增加miR-22的表达，抑制大鼠模型中的caspase-3的活性，减少神经元的凋亡。同时，SIRT1的下调减少miR-22的表达，增加caspase-3的活性，神经元凋亡增加。这些miRNAs均通过影响细胞凋亡通路在CIRI中发挥作用。

4. 展望

综上所述，特异性miRNAs通过调控凋亡相关通路、氧化应激、能量代谢、Ca²⁺超载、炎症反应、自噬相关蛋白等参与CIRI进程。miRNAs广泛参与CIRI的发生发展过程，相关miRNAs被发现，将进一步在基因水平揭示CIRI的病理生理过程，为CIRI的防治提供新的思路和方向。

基金项目

青岛市科技民生项目(19-6-1-50-nsh)。

NOTES

^*通讯作者。