1. 引言
自交不亲和(self-incompatibility, SI)是植物经过长期自然进化形成一种特殊的生殖隔离机制，这种现象对于维持物种的遗传多样性有着重要作用 [1]。目前，人们发现在蔷薇科、茄科、玄参科、罂粟科和十字花科等80多个科的3000多种植物中广泛存在着自交不亲和现象，并对其进行了相关研究 [2] [3] [4] [5] [6]。
沙田柚属芸香科柑橘属果树，为高度自交不亲和。薛妙男等 [7] [8]、杨继华等 [9] [10]、秦新民等 [11] [12] [13] 对沙田柚自交不亲和的细胞学、蛋白质化学，以及相关基因进行了相关研究，证实了沙田柚的自交不亲和属于配子体自交不亲和类型，发现了自交花柱中一些蛋白参与了自交不亲和过程，并对一些相关基因进行了克隆和功能验证。
MicroRNA (miRNA)为基因组中一类内源性的非编码RNA片段，长度约为19~24 nt。对植物的生长发育、代谢、信号转导、胁迫应答等生理过程有重要的调节功能 [14] [15] [16] [17]。但目前在植物自交不亲和研究中尚未见涉及miRNA的研究报道。本研究以自交和异交1、2、3天花柱为材料，构建小RNA测序文库，进行miRNA测序和分类注释，对差异表达的miRNA进行靶基因预测，并对靶基因所在的GO功能注释以及KEGG pathway注释，探讨miRNA在沙田柚自交不亲和中的作用。
2. 材料与方法
2.1. 材料处理与收集
实验材料为沙田柚(Citrus grandis var. Shatianyu Hort)花柱。在沙田柚的盛花期(4月中旬)分别对沙田柚样树进行人工自花授粉(沙田柚×沙田柚)和异花授粉(酸柚×沙田柚)，然后分别采集自交1~3 d (标记为ZJ1、ZJ3、ZJ3)和异交授粉1~3 d (标记为YJ1、YJ2、YJ3)后的花柱，立即放入液氮，保存于−80℃超低温冰箱中备用。
2.2. 总RNA的提取及文库构建
总RNA的提取采用TRIzol试剂盒(Invitrogen公司)并参照其操作手册进行。建库与测序由华大科技有限公司进行。
2.3. 花柱中miRNA的鉴定
将获得的sRNA经过blast或者bowtie比对到miRBase数据库，鉴定得到已知的miRNA。新miRNA采用华大自主开发的Mireap软件进行预测。
2.4. miRNA靶基因的预测、GO功能注释及KEGG代谢通路分析
采用psRobt和TargetFinder软件进行miRNA靶基因的预测。靶基因进行GO功能富集显著性分析与KEGG 代谢通路富集性分析分别采用GO数据库(http://www.Geneontology.org/)和KOBAS (2.0)软件进行。
3. 结果
3.1. 测序数据统计
文库测序获得的Raw Data经过去除低质量的序列、3’端接头、5’端接头污染物、polyA，以及小于18 nt序列等，6个样品获得的clean reads分别为：23046850 (YJ1)、12556786 (YJ2)、23949192 (YJ3)、20472150 (ZJ1)、18567950 (ZJ2)、22197840 (ZJ3)。通过对6个样品的sRNA进行了长度统计，大多数已知功能的sRNA的长度介于20~24 nt，6个样品的sRNA长度分配模式一致，21 nt的sRNA的丰度最高，占clean reads的比例都在47.75%以上，接着是24 nt、22 nt和23 nt，符合植物sRNA的长度分配。
3.2. sRNA分类注释
在所有注释信息中，可能存在一个sRNA同时比对上两种不同注释信息的情况。为了保证每个unique sRNA只有一个注释，根据rRNAetc > known miRNA > piRNA > repeat > exon > intron的优先顺序将sRNA进行比对 [18]，没有比对上任何注释信息的sRNA用unann来表示。本实验6个样品的sRNA的分类注释信息见表1。
Table 1. Annotation of sRNA classification
表1. sRNA分类注释
3.3. 已知miRNA的家族分析
将6个样品所获得的sRNA通过blast或bowtie比对到miRBase数据库(http://www.mirbase.org/)，获得已知miRNA及所属家族。结果表明6个样品中已知的miRNA属于27个家族和一个尚未定义的家族，结果与甜橙所含有的miRNA家族一致。
3.4. 新miRNA的预测
对未注释上任何RNA但比对上基因组外显子反义链、内含子以及基因间的sRNAs，利用生物信息学分析软件Mireap或mirdeep对其进行分析。经过比对注释，在YJ1、YJ2、YJ3、ZJ1、ZJ2、ZJ3中分别鉴定出1184、476、836、640、739和801个新miRNA。
3.5. 自交与异交花柱间差异表达的已知miRNA和新miRNA分析
分别比较YJ1/ZJ1、YJ2/ZJ2、YJ3/ZJ3归一化表达水平的miRNA，以log2绝对值大于1为筛选条件，寻找差异表达miRNA。结果在YJ1/ZJ1、YJ2/ZJ2、YJ3/ZJ3的比对中共获得了16个差异表达的已知miRNA以及23个差异表达的新miRNA (表2)。
Table 2. Differential expression miRNA between cross-pollinated and self-pollinated styles
表2. 异交/自交花柱差异表达miRNA
注：表中数值为2个样品间表达量的log2值。
3.6. 自交和异交上调或下调差异表达miRNA分析
对自交和异交花柱中持续上调或下调的miRNA的分析有助于自交不亲和相关miRNA确定。因此本文对自交和异交授粉花柱中持续上调或下调的miRNA进行统计，在异交1~3 d花柱中持续上调的miRNA为28个，其中，已知miRNA 23个，新miRNA 5个。而在异交1~3 d持续下调的miRNA仅为4个，其中，已知miRNA 2个，新miRNA 2个。
在自交在异交1~3 d花柱中持续上调的miRNA为21个，其中，已知miRNA 20个，新miRNA 1个。持续下调的miRNA为12个，其中，已知miRNA 7个，新miRNA 5个。
3.7. 自交和异交花柱特有差异表达miRNA及其靶基因功能
对沙田柚自交授粉和异交授粉的特有miRNA及靶基因参与的GO与KO代谢途径进行分析，发现自交花柱特有的miRNA为40个，异交花柱特有的miRNA共32个。这些miRNA靶基因的功能涉及到RNA降解、转录因子、植物激素、植物与病原菌相互作用、结合功能、激酶以及蛋白质在内质网的合成等代谢过程。
4. 讨论与结论
目前，已有研究表明miRNA在植物发育过程中扮演着重要角色，但关于miRNA与植物自交不亲和的相关性研究很少。本研究通过sRNA测序，在沙田柚自交与异交花柱中鉴定出了多个差异表达的已知miRNA和新miRNA，以及在自交和异交花柱中特异表达的miRNA，并对这些miRNA进行靶基因预测对靶基因进行GO、KO功能注释，筛选出可能与自交不亲和反应相关的miRNA。
4.1. 异交花柱中与自交不亲和相关的特异表达miRNA
在异交花柱特有的miRNA中，novel_mir_1240靶基因功能为E3泛素蛋白连接酶以及S-位点糖蛋白；novel_mir_1305靶基因功能为β-1,4-内切葡聚糖水解酶和内切葡聚糖酶；miR7545靶基因功能为细胞骨架组织、调节ARF蛋白信号传导、果糖激酶；novel_mir_1399靶基因功能包括F-box蛋白和cyclin蛋白；novel_mir_1303靶基因功能为乙烯应答转录因子。这些miRNA只在沙田柚异交样品中特异性表达而在自交样品中不表达，说明这些miRNA起负调控作用，抑制其对应的靶基因在异交花柱中的表达，使得异交花粉管正常生长而自交花柱被抑制发生自交不亲和反应。由于这些miRNA大部分为新的miRNA，关于其在自交不亲和中的具体功能还需进一步研究。
4.2. 自交花柱中与自交不亲和相关的特异表达miRNA
在自交样品中特异性表达的miRNA包括：novel_mir_2344靶基因功能为果胶酯酶抑制剂；miR9470-3p靶基因功能有γ-氨基丁酸(GABA)受体和参与糖酵解途径；miR9560a-5p靶基因功能为壁相关受体激酶；miR395靶基因功能为半乳糖代谢和在细胞壁的合成中也发挥一定作用；miR2118b靶基因功能为热激蛋白和分子伴侣功能；miR8775靶基因功能包括有泛素调节蛋白酶体途径。花粉管在花柱中的生长过程中，需要果胶酯酶水解柱头细胞壁的果胶使得花粉管能继续生长，同时，花粉管的伸长也需要不断的合成细胞壁。此外，阿拉伯半乳糖蛋白在花粉管生长和引导等方面发挥着作用。而novel_mir_2344、miR9560a-5p和miR395在自交样品中特异性表达，说明这些miRNA可能负调控其靶基因的表达，使自交花柱中的花粉管生长受阻。
GABA在花粉–雌蕊互作中起到信号作用，且GABA的浓度梯度被破坏时会使花粉管生长异常 [19] [20]，同时花粉管的生长需要能量，糖酵解途径可以提供大量的能量，miR9470-3p靶基因功能为GABA受体以及参与糖酵解途径，说明可能通过负调控靶基因使得GABA浓度发生改变以及破坏花粉管生长的所需的能量供应，使花粉管生长受到影响。
Poulter等 [21] 在拟南芥自交不亲和样品中发现5个热激蛋白/分子伴侣蛋白有着更高的表达量，在自交不亲和中可能有一定的作用，而miR2118b的靶基因功能为热激蛋白/分子伴侣蛋白，并在自交中特异性表达，说明该miRNA也可能在自交不亲和中发挥作用，关于其功能以及调控方式还有待进一步研究。
在自交样品中，miR9560a-5p与novel_mir_651也表现为持续上调表达，即在自交3天过程中一直高表达。其靶基因所对应的功能为蛋白激酶和壁受体相关蛋白激酶，壁受体激酶是一种跨膜蛋白，其胞外结构域与细胞壁中的果胶组分相连接，可能影响细胞壁的合成。而miR9560a-5p在自交样品中表达量持续上调，可能对其靶基因发挥负调控作用，使花粉管的细胞壁合成收到影响进而促进自交不亲和反应发生。
novel_mir_651在自交中也存在差异性表达，在自交样品中持续上调，其对应的靶基因功能主要为转录因子以及植物激素信号传导。根据novel_mir_651靶基因的KO功能注释，发现靶基因参与到植物激素信号传导中油菜素内酯的跨膜运输过程。油菜素内酯主要是通过膜上的BAK1和BRI1两个载体进出细胞，而novel_mir_651靶基因参与BRI1运输油菜素内酯，油菜素内酯通过修饰细胞壁的方式影响细胞的伸长，或调控细胞壁合成基因进而影响细胞壁合成。目前已在甜樱桃中发现油菜素内酯诱导花粉管的伸长 [22]。novel_mir_651在自交花柱样品中持续上调且只在自交样品中特异性表达，说明其可能在自交不亲和反应中对花粉管的伸长发挥一定的作用，对其靶基因进行负调控作用使花粉管生长受到抑制。
此外，miR845在自交样品中表现为持续下调，miR5185l-3p、miR398a-3p则为持续上调，但是没有发现相应的靶基因，关于这三个miRNA是否参与自交不亲和以及其对应的功能还需要进一步研究。
4.3. 自交与异交花柱中与自交不亲和相关的差异表达miRNA
4.3.1. miRNAmiR160家族
本研究获得三个miR160家族的miRNA，包括miR160a-5p、miR160g、miR160b。它们共同作用的靶基因为生长素应答因子auxin response factor。生长素能促进细胞的伸长和分裂，其信号传导在调节花粉管伸长过程发挥至关重要的作用 [23]。对花粉中特有的生长素输出载体PIN8的研究也表明生长素在花粉管生长中发挥作用 [24]。Pin8突变型花粉与野生型花粉相比萌发率下降，当pin8在花粉中过表达花粉管伸长时对NPA (萘基邻氨甲酰苯甲酸，抑制生长素运输)的抗性增强 [25]。对miR160家族的靶基因进行KO注释，发现靶基因都注释到生长素运输途径中的ARF家族转录因子。由此可知，miR160家族miRNA负调控生长素在自交花粉管的转运，使得花粉管生长受阻，可能是自交不亲和反应的部分原因。
4.3.2. miR5059和miR172a-5p
miR5059靶基因数目较多，靶基因功能包括有磷脂酶D、E3泛素蛋白连接酶、木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶和生长素应答蛋白等。其中生长素应答蛋白基因的KO注释为AUX/IAA，除了在传导生长素信号途径中发挥作用，同时AUX/IAA还连接着植物信号传导途径中的生长素传导途径与泛素调节蛋白酶体途径。而miR172a-5p靶基因则注释到泛素调节蛋白酶体途径中的E3复合体的skp1。miR172a-5p靶基因功能还包括有三角状五肽(PPR)、谷氨酰转移酶、泛素系统组成成分和ABC蛋白组成蛋白等。S-RNase对自我花粉管发挥细胞毒素作用，也可能通过核酸酶活性直接抑制自我花粉管生长 [26]，或者间接发挥细胞毒素作用导致细胞死亡 [27]。miR5059和miR172a-5p的靶基因参与了泛素调节蛋白酶体的代谢途径，通过非自我S-RNase解毒作用，可能在自交不亲和反应中发挥了重要作用。
4.3.3. novel_mir_1770
novel_mir_1770靶基因功能注释之一为磷脂酰肌醇4-激酶的靶基因，KO注释包括有肌醇磷酸代谢和磷脂酰肌醇信号系统。在肌醇磷酸信号途径中，磷脂酰肌醇4-激酶主要把甘油磷酸代谢途径产生的Phosphatidyl-1D-myo-inositol传递并转换成1-Phospatidyl-1D-myo-inositol-4p(PI(4)P)，随后转化为PI(4,5)P2。而PI(4,5)P2在花粉管生长过程中对囊泡运输以及细胞骨架重排中发挥着重要作用 [19]。过多或过少的PI(4,5)P2都会影响囊泡运输，从而影响花粉管的生长 [28]。所以，novel_mir_1770也可能参与到沙田柚自交不亲和反应中。
总之，沙田柚的自交不亲和反应过程涉及到众多的复杂反应过程，但目前关于miRNA与植物自交不亲和的相关性研究很少，值得开展深入研究，以期阐明沙田柚自交不亲和的分子机理。
基金项目
国家自然科学基金(31360477)；广西教育厅项目(2013YB036)。
NOTES
*通讯作者。