硅酸铜空心球纳米药物载体的合成及应用研究

Study on Application and Synthesis of Hollow Copper Silicate Nanosphere-Based Nano-Drug Carrier

摘要: 目的：一种新型的基于硅酸铜空心纳米球的纳米载体被设计出来用于抗癌药物DOX的递送，并对其结构、性能以及细胞毒性进行了研究。方法：通过“自牺牲模板”的方法，利用二氧化硅纳米球作为模板，经过一步水热合成法制备了硅酸铜。通过SEM、TEM、Zeta电位、紫外吸收光谱和红外光谱对其形貌、结构以及表面特性等进行了表征。结果：合成的硅酸铜纳米颗粒的形貌是类似海胆状的空心球，且球的平均直径约为210 nm，表面电荷为−18.5 mV。由于其空心结构使得负载DOX的量达到了10 wt%。结论：在本研究中，通过模板法合成了硅酸铜空心纳米球并负载DOX后，实现了对pH响应性的可控释放。细胞毒性结果表明，相对于单独的DOX，纳米载体负载后能显著提高其肿瘤治疗效果。

Abstract: Purpose: A novel nanocarrier based on copper silicate hollow spheres was rationally designed for delivery of anticancer drug of DOX, and its structure, performance, and cell toxicity was studied. Method: Copper silicate was synthesized via the “self-sacrificing template” approach by using silica nanospheres as the templates with one-pot hydrothermal method. The morphology, structure, and surface characteristics have been studied through SEM, TEM, Zeta potential, UV-vis and FTIR. Results: The morphology of the synthesized copper silicate is similar to the urchin-like hollow sphere with the average diameter of 210 nm, and the surface charge is about −18.5 mV. Conclusion: In this study, copper silicate hollow nanospheres were synthesized by template method and loaded with DOX drugs to achieve a controlled release in response to pH. The results of cell cytotoxicity indicated that the nanocarrier showed a significantly therapeutic efficacy in comparison with free DOX.

1. 引言

近年来，基于纳米药物载体用于提高抗肿瘤药物的治疗效果方面的研究受到了广泛的关注 [1]。相对于传统的化疗方式采用直接注射的方法，基于纳米载体的药物体系的化疗具有明显的优势，如：纳米载体能够通过肿瘤部位的丰富的血管组织渗透并富集 [1]；能够通过胞吞作用将纳米药物递送到细胞内，克服肿瘤细胞的耐药性 [2]；通过纳米载体能够大大延长纳米药物在体内的循环时间，实现高效的治疗 [3]；通过设计可实现对抗肿瘤药物的可控释放等 [4] [5]。国内外的学者在开发新型的靶向纳米药物载体上都取得了一定的研究进展，大量的纳米载体被合成出来，如超顺磁性的铁氧化合物、金基的纳米颗粒、碳基纳米材料、介孔二氧化硅等 [6] - [11]，而且由于这些纳米材料的特性不仅可作为纳米药物载体还可以用于生物成像、核磁共振成像、光热治疗等应用。然而，这些纳米载体仍然存在着很多的缺点，如合成过程比较繁琐、成本比较高、生物不可降解、易在体内累积存在长期的毒性等问题，因此限制了这些纳米载体的广泛使用。因此，发展一种简单、廉价、普适、绿色的合成方法制备低毒、高生物相容性的、高效的、智能肿瘤靶向的纳米药物载体具有非常重要的现实意义。

由于其具有较大的比表面积、可调的孔径、高的负载率和可控的药物释放，空心结构的纳米材料可被广泛应用于纳米生物医学领域 [12] [13] [14] [15]。基于此，在本研究中利用二氧化硅(SiO₂)作为模板，采用“自牺牲模板”的方法，得到了一种具有海胆状的硅酸铜(CuSiO₃)的空心纳米球。利用其内部的空心结构负载抗癌药物阿霉素(DOX)，通过胞吞方式将药物递送到肿瘤细胞内，且实现了对肿瘤微环境响应的可控释放过程，显著提高了化疗药物的治疗效果。该纳米载体的成功制备可为设计合成具备空心结构载体提供了一种新的思路，而且有望实现在纳米医学领域的潜在应用。

2. 实验部分

2.1. 仪器与试剂

扫描电子显微镜(ZEISS Gemini SEM 300)；透射电子显微镜(Talos F200X)；紫外–可见吸收光谱(UV-Vis)；傅立叶转换红外光谱仪(FTIR)；马尔文粒径电位分析仪；荧光显微镜(Leica TCS SP8)。

无水乙醇，氨水，硅酸四乙酯(TEOS)，三水合硝酸铜，盐酸阿霉素(DOX)，mPEG-silane (Mw = 5000)，PBS缓冲溶液等均为分析纯购买自上海阿拉丁试剂有限公司；实验所用均为去离子水。

2.2. CuSiO₃-PEG@DOX纳米载药体系的构建

2.2.1. 硅酸铜空心球的合成

190 nm左右的二氧化硅纳米球采用经典的Stöber方法合成的。接着，将0.7 mmoL Cu(NO₃)₂·3H₂O和1 mL氨水混合到30 mL去离子水中，置于圆底烧瓶中。取上述合成的二氧化硅(70 mg)均匀分散在20 mL的去离子水中并超声5 min。将以上两种均匀溶液进行混合，并磁力搅拌20 min，接着将混合溶液转移到100 mL的高压反应釜中，放入预热的烘箱里，置于140℃下进行反应10 h。待反应完成后，离心收集产物，用去离子水和乙醇各洗涤三次，保存在50 mL的无水乙醇中。对所得到的产物的其结构、形貌进行SEM、TEM、红外光谱、紫外可见光谱等表征。

2.2.2. 硅酸铜表面PEG修饰及负载DOX

将上述合成的硅酸铜的乙醇溶液中加入1 mL的氨水和100 mg的mPEG-silane，在氮气保护下70℃回流12 h。反应结束后，离心收集产物并用乙醇和水洗涤多次，最后分散在去离子水中。

取一定量的CuSiO₃-PEG加到DOX的溶液(1 mg/mL)中，常温下避光搅拌24 h后，离心收集产品，并用去离子水洗涤。并通过紫外可见吸收光谱测定负载前后DOX溶液的吸光度，并通过标准的DOX的吸光度与浓度曲线，计算出CuSiO₃-PEG负载DOX的量约为10 wt%。DOX药物负载量计算公式：DOX负载量 = (W_{加入的DOX质量} − W_{未负载的DOX质量})/W_{CuSiO3-PEG@DOX}(%)。

2.2.3. DOX药物释放

一定量的CuSiO₃-PEG@DOX分散在不同pH值的PBS缓冲溶液中(pH = 4.5, 6.0, 7.2)，在室温条件下磁力轻微搅拌，每隔1 h取一定量的溶液并离心收集上清液，通过紫外可见光谱测定其吸光度。对照DOX标准曲线计算其释放的含量。

2.2.4. 细胞毒性试验

Hep-G2肿瘤细胞安排每个孔1 × 10⁶个细胞浓度分散到培养液中，接着取200 μL培养液分别加入到96孔板中，在37℃下5%的CO₂条件下培养24 h。接着每个孔中加入不同浓度的CuSiO₃-PEG，DOX，CuSiO₃-PEG@DOX进行培养。继续培养24 h后，加入新鲜的含有5 mg/mL的MTT的DMED溶液，并孵育4 h。除去上清液并加入150 µL的DMSO溶剂并震荡10 min后，用酶标仪测定。

3. 结果与讨论

3.1. 硅酸铜空心球的形貌与结构表征

二氧化硅纳米球是通过硅酸四乙酯在碱性条件下水解得到的(经典的Stöber合成法) [16]。从图1(a)中的SEM电镜图片可以看出，合成的SiO₂分散非常均匀的纳米球，且直径约为190 nm。利用二氧化硅小球作为模板，经过一步水热法得到了硅酸铜。如图1(a)和图1(b)中TEM电镜图片所示，得到的CuSiO₃是分散相对比较均匀的纳米球，进一步放大图片可以清晰看出合成的CuSiO₃纳米球是内部空心的结构，且外壳是由纳米片组装而成的类似海胆状形貌。相对于SiO₂纳米球，CuSiO₃纳米球的直径由略微的增大约为200 nm左右，这与图2(a)中的DLS分析结果是一致的。空心纳米球的元素组成用X-射线能谱元素分析进一步确认。如图1(d)中所示，STEM-HAADF图片揭示了合成的纳米球是空心结构且外壳呈现出分级结构。元素分析表明，Cu、Si、O三种元素均匀分布在纳米球的外壳上。合成的纳米球用XRD表征了其晶体结构，如图2(b)所示，对照标准的硅酸酮卡片(JCPDS 03-0219)，合成的产物的XRD与标准卡片基本上吻合，证明了产物为CuSiO₃ [17]。但是从XRD图片也可以看出合成的产物CuSiO₃的结晶性比较差。此外，从红外图谱上也可以看出，对比二氧化硅反应前后红外光谱发现，反应后产物在957 cm⁻¹和800 cm⁻¹处的吸收峰消失了，而1090 cm⁻¹处的吸收峰则发生了迁移，这可能是由于形成了Si-O-Cu键而导致的 [18]。通过以上的结构与物相以及元素分析结果表明合成的产物是CuSiO₃空心纳米球。

Figure 1. (a) SEM image of SiO₂ nanospheres; (b) TEM image of CuSiO₃ hollow nanospheres; (c) partial high-magnification image of b; (d) STEM-HAADF and element mapping images of image of CuSiO₃ hollow nanospheres: (e) Cu element; (f) Si element; (g) O element

图1. (a) SiO₂纳米球的SEM图片；(b) CuSiO₃空心纳米球的TEM图片；(c) 图片b的部分放大图；(d) CuSiO₃空心球的STEM-HAADF和元素分布图片：(e) Cu元素；(f) Si元素；(g) O元素

Figure 2. (a) DLS of CuSiO₃ hollow nanospheres; (b) XRD pattern of CuSiO₃

图2. (a) CuSiO₃空心球的DLS图谱；(b) CuSiO₃的XRD谱图

3.2. DOX药物释放

为了提高CuSiO₃纳米球的生物相容性，生物性高分子PEG被修饰到了其表面，从图3(c)中纳米载体的Zeta电位的变化可以看出，CuSiO₃-PEG被成功地合成出来。由于具备空心结构，合成的CuSiO₃纳米球可以作为抗癌药物DOX的载体用于体内的药物递送。CuSiO₃纳米球加入到DOX的溶液中通过物理吸附将药物负载到纳米载体上，利用紫外可见光谱测试表明，CuSiO₃纳米载体负载DOX的含量可达到10 wt% (图3(b))。负载药物后，Zeta电位也发生了明显的变化，这也证明了抗癌药物DOX被成功地负载到了CuSiO₃纳米载体上(图3(c))。我们进一步研究了纳米药物载体在不同pH条件下的药物释放过程。如图3(d)中所示，在中性条件下，纳米药物载体几乎不释放出DOX。当溶液的pH减少到6.0时，大约有62%的DOX从载体上释放出来。随着pH进一步降低到4.5，释放出来的DOX达到了90%。这些结果表明，DOX药物从载体上释放过程时受pH影响的。通常肿瘤部位的pH相对正常组织来说是偏酸性的，而肿瘤细胞内的微环境更偏酸性pH约为4.5~5.0。这也说明了我们合成的纳米药物载体在体内循环时能够避免不必要的释放，保证了纳米药物载体在肿瘤细胞内的充分释放，从而能显著提高化疗的效果同时减少对正常组织和细胞的伤害。

Figure 3. (a) FTIR spectra of SiO₂ and CuSiO₃; (b) UV-vis absorbance spectra of CuSiO₃-PEG, DOX, and CuSiO₃-PEG@DOX; (c) Zeta potential of CuSiO₃,CuSiO₃-PEG, and CuSiO₃-PEG@DOX; (d) DOX release profiles from CuSiO₃-PEG@DOX in PBS buffer at pH values of 7.2, 6.0, and 4.5

图3. (a) SiO₂和CuSiO₃的FTIR光谱；(b) CuSiO₃-PEG，DOX和CuSiO₃-PEG@DOX的紫外可见吸收光谱；(c) CuSiO₃，CuSiO₃-PEG和CuSiO₃-PEG@DOX的Zeta电位；(d) CuSiO3-PEG/DOX在pH值为7.2, 6.0和4.5的PBS缓冲溶液中的药物释放曲线

3.3. 细胞毒性研究

以Hep-G2肿瘤细胞为模型，对纳米载体的毒性进行了考察。从图4(a)中MTT结果表明，合成的CuSiO₃-PEG纳米载体具有优异的生物相容性，即使在浓度高达160 μg/mL时，肿瘤细胞的存活率仍然达到了95%以上。纳米药物载体CuSiO₃-PEG@DOX的细胞毒性结果表明，相对于单独的DOX药物，结合纳米载体后明显提高了DOX药物的化疗效果。例如，浓度为16 μg/mL的DOX与Hep-G2细胞培养24 h后，细胞存活率约为30%；在等量的DOX浓度下，CuSiO₃-PEG@DOX处理组的肿瘤细胞存活率下降到了8%，说明结合纳米载体后能显著提升化疗药物的治疗效果。从图4(b)中细胞死活染色的荧光图片也可以看出，PBS和CuSiO₃-PEG处理组的细胞几乎没有死亡；单独DOX药物组处理的细胞部分死亡了；而CuSiO₃-PEG@DOX处理组的Hep-G2细胞几乎全部死亡了，这与上述的MTT实验得到结果是相一致的。

Figure 4. (a) Hep-G2 cell viabilities incubation with different concentrations of CuSiO₃-PEG, free DOX, and CuSiO₃-PEG@DOX; (b) live/dead cell staining assay to visualize the cell viability of Hep-G2 cells under different treatments

图4. (a) Hep-G2细胞分别与不同浓度的CuSiO₃-PEG, DOX和CuSiO₃-PEG@DOX共培养后的细胞活性；(b) 不同处理组的Hep-G2细胞的死活染色的荧光照片

4. 结论

在本文中，我们发展了一种“自模板牺牲”的方法，利用二氧化硅纳米球作为模板，在碱性条件下通过一步水热的方法合成了表面多刺状的硅酸铜空心纳米球，并对其结构和性能进行了详细的表征。为了进一步提高其生物相容性，在其表面修饰了PEG，得到了具有优异生物相容性的CuSiO₃-PEG纳米载体。由于其空心的结构，可以负载抗肿瘤药物DOX，且负载量达到了10 wt%。进一步的细胞实验表明，相对于单独的DOX药物，合成的CuSiO₃-PEG@DOX对Hep-G2肿瘤细胞显示出更强的细胞毒性，显著提高了化疗的效果。此外，本论文也为设计合成空心结构的纳米药物载体提供了一种新的方法。

基金项目

本项目由国家自然科学基金(批准号：22007052)，江苏省自然科学基金(批准号：BK20190917)，江苏省高校基金(批准号：19KJB150015)和南通大学博士科研启动基金支持。