血小板活化及内皮细胞在原位肺动脉血栓形成中作用机制的研究进展

Research Progress in the Mechanism of Platelet Activation and Endothelial Cells in In Situ Pulmonary Artery Thrombosis

摘要: 普遍认为，肺栓塞是由静脉血栓脱落，随血流进入肺动脉造成梗死。这一概念在临床实践中持续了一个多世纪。但随着越来越多的检查技术的出现，发现了在许多情况下，越来越多的肺栓塞找不到明显的栓子来源。包括慢性阻塞性肺疾病、哮喘、急诊/择期手术、病毒性肺炎等，上述疾病都有发现肺栓塞的形成，却未发现深静脉血栓。对于原位肺动脉血栓形成的过程，经过实验及临床观察证明，内皮细胞及血小板活化起了关键性作用。内皮功能障碍、缺氧、炎症细胞因子、基因突变等均是原位肺动脉血栓形成的基础。这篇综述将会讨论原位肺动脉血栓形成的潜在机制。

Abstract: It is generally believed that the pulmonary embolism is from venous thrombosis, and the blood flow is formed into pulmonary artery. This concept lasted for more than a century in clinical practice. However, with more and more inspection techniques, the embolus is not found in many pulmonary embolism cases, including chronic obstructive pulmonary disease, asthma, emergency/alternative surgery, viral pneumonia, etc. The above diseases have foundation of pulmonary embolism without deep vein thrombosis. After experimentation and clinical observation, endothelial cells and platelet activation plays a key role in the formation of in situ pulmonary artery thrombosis. Endothelial dysfunction, hypoxia, inflammatory cytokine, gene mutation, etc. are the foundations of in situ pulmonary artery thrombosis. This review will discuss the potential mechanism of the in situ pulmonary artery thrombosis.

1. 引言

在19世纪，Rudolf Virchow提出了一个持续一个半世纪的理论，他认为肺动脉栓塞是由外周静脉系统血栓迁移导致。这种看法在现在的临床实践中仍然占据主导地位。然而，随着临床数据的积累，发现越来越多肺栓塞病例并没有合并静脉血栓形成，原发肺动脉血栓形成进入人们视线。

2. 肺栓塞

在一个全球多中心的静脉血栓栓塞症(VTE)患者的研究(Registro Informatizado de la Enfermedad Trombo Embolica, RIETE)中，涉及2984例慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者的肺栓塞发生率为59% [1]。其中就包括无深静脉血栓(DVT)的肺栓塞患者。然而，对这些患者的随访显示，在复发血栓栓塞事件及死亡病例中，肺动脉再发血栓形成(无DVT)占主要地位 [1]。氧饱和度低、呼吸困难等会增加肺动脉血栓形成的风险，有研究报告显示5%~39%的COPD患者发生肺动脉血栓 [2]。不光是COPD患者，哮喘、镰状细胞贫血、急性胸痛综合征、急性创伤、缺氧、急诊手术、病毒感染等也都具有肺栓塞发生的高风险 [2]。

3. 血小板在肺动脉血栓形成中的作用

3.1. 血小板活化

当血管壁受到损伤时，会使胶原蛋白裸露，而血小板对胶原纤维有强亲和力，会使血小板迅速粘附于损伤位置，血小板发生聚集，并释放许多生物活性物质，这些物质又可加重血小板的聚集，有利于形成血栓。且一般创伤、手术后、妊娠及产后等，会引起血小板增高，粘附性增强，同时释放出凝血因子，这些凝血因子参与血液循环，使血液呈高凝状态，而为血栓形成创造了条件。同时，血流变慢后易形成涡流现象，进一步导致血小板滞留，使血液凝固、血栓形成。

血小板活化过程：当内皮受损时，GPIbα与vWF结合，引起GPIb细胞内结构发生变化，信号传递后，引起酪氨酸激酶被激活，酪氨酸激酶激活PI3K，当PI3K激活后，会和细胞膜上的PIP2结合，使其磷酸化为PIP3，进而激活下游通路，这是血小板先期应答的过程 [3] [4]。蛋白激酶B (AKT)的PH区与PIP3结合，同时PDK1募集到细胞膜，AKT与PDK1结合后部分激活，再与PDK2结合进行磷酸化，使其完全激活，AKT通过磷酸化的方式将能量传递给血小板内的NOS，NOS作用于左旋精氨酸生成瓜氨酸和NO，作用于下游SGC，使第二信使cGMP升高，随着细胞内cGMP升高，依赖cGMP的蛋白激酶PKG被激活，激活了MAPK通路(在血小板中，被激活的是P38和ERK这两个酶)，而位于细胞膜上的受体PLA2与ERK结合，释放出花生四烯酸，花生四烯酸作为前列腺素、血栓烷素A2、白三烯等的前体物质，花生四烯酸在COX和血栓素合成酶的作用下形成TXA2后释放，而TXA2的作用是使血小板粘附和变形。TXA2与血小板细胞膜上G蛋白偶联受体结合后使PIP2产生DAG和IP3引起细胞应答，DAG主要激活下游通路，IP3主要负责释放钙离子，使血小板完成黏附过程 [3] [4] [5] [6] [7]。

活化的血小板可能在肺动脉血栓形成中发挥作用。在华法林和阿司匹林(WARFASA)和阿司匹林预防复发性静脉血栓栓塞(ASPIRE)试验中表明，抗血小板药物抑制血小板活性可降低抗凝治疗停止后肺动脉血栓事件复发的风险 [8]。在实验中，通过香豆素衍生物或酪氨酸激酶MER (MERTK)抑制剂UNC2025抑制血小板活化，可降低死亡率 [9]。下文将讨论PA血栓形成可能几种血小板激活机制。

3.2. PAR依赖的血小板激活

只有两种类型的PAR受体在人类血小板上表达：PAR-1和PAR-4，PAR-1对凝血酶具有更强的亲和力，因此较低的凝血酶浓度就能激活，PAR-1参与以Ca²⁺依赖的血小板激活 [10]。活化的血小板诱导内皮表面粘附分子如ICAM-1、VCAM-1、vWf和TF的表达，从而促进白细胞迁移、血小板粘附到内皮，活化血小板上的p-选择素与白细胞上的p-选择素糖蛋白配体(PSGL-1)结合，使得白细胞–血小板复合物的形成，并激活白细胞 [11]，促进凝血，在肺动脉血栓形成中发挥重要作用。

3.3. RAGE依赖的血小板激活

肺动脉内皮细胞和血小板的激活可由晚期糖基化终产物受体(RAGE受体)介导，肺动脉内皮细胞至少含有两种RAGE亚型，当血液循环过程中被促炎细胞因子和红细胞刺激时，导致表面粘附分子的表达 [12]。HMGB1通过与RAGE的相互作用激活血小板，刺激中性粒细胞释放NETs，NETs通过促进血小板的凝血、粘附和聚集(主要是由于组蛋白H3和H4)和招募红细胞来发挥血栓前作用 [13]。

3.4. 缺氧在血小板活化中的作用

COPD患者的血小板表达的HIF2α水平高于健康人，PaO₂低于60 mmHg的患者中，血小板中HIF2α和PAI-1的水平均增强 [14]。在大鼠实验中，高海拔缺氧促进了血小板与胶原蛋白和纤维蛋白原的粘附，海拔3000米以上VTE患者血浆中可溶性p-选择素值较高，这表明血小板处于持续激活状态 [15]。

3.5. 免疫反应与血小板激活

有临床研究发现，病毒感染时，巨核细胞和血小板与炎症因子的相遇激活和启动了免疫反应。免疫反应中涉及巨核细胞和血小板的信号通路可能因不同病原体而异，因此，血小板活化诱导的血栓形成通过多种机制上调，如刺激TLR-3受体、TLR-9-MyD88信号通路或FcγRII [16]。血小板和白细胞粘附到内皮，以及NETs的释放，这些结合导致肺泡–毛细血管屏障破坏，引起肺动脉血栓形成 [17]。

3.6. 抗血小板治疗与肺栓塞

有研究表明，在VTE (静脉血栓栓塞症)高危患者中使用抗血小板药物，可明显降低DVT (深静脉血栓)和PTE (肺血栓栓塞)发病率 [18]。但是还有其他研究表明单独使用抗血小板药物较普通肝素、低分子肝素等预防VTE效果较差。一项VTE一级预防的随机临床试验(778例)示，在髋关节成形术后的患者，使用达肝素钠10天后继续应用阿司匹林预防28天的效果与达肝素钠相似，且安全性与达肝素钠相似 [19]。2016年VTE抗栓治疗指南建议，高危VTE患者如果有抗凝药物使用禁忌时，可选择阿司匹林；近端DVT患者及肺栓塞患者在给与初始抗凝后，可选用阿司匹林作为VTE二级预防药物 [20]。提示阿司匹林能够作为VTE高危患者预防性抗栓治疗的药物 [21]。

4. 肺动脉内皮细胞在原位肺动脉血栓形成的机制

4.1. 肺动脉内皮细胞的结构特征

肺动脉内皮细胞具有复杂的功能，包括屏障功能，气体交换、血管张力调节、凝血功能、白细胞滤过和血管通透性。肺动脉内皮由细胞间相互作用蛋白、结构蛋白和细胞骨架蛋白形成单层。肺动脉内皮的促凝血作用可由多种因素介导，如vWf、P-选择素、TNF、ROS，以及eNOS和APCPKC活性的调节以及糖萼的功能 [22] [23]。例如：

1) 在肺动脉血栓形成过程中，内皮细胞的结构蛋白caveolin-1参与一氧化氮(NO)的产生，并调节蛋白C对蛋白酶介导的受体-1 (PAR-1)的作用，eNOS直接与caveolin-1结合，调控eNOS的功能和NO的产生 [22] [23] [24]。NO在抗血栓机制中的作用是防止血小板粘附到血管壁上,研究表明，NO抑制剂会增加血管中的血小板沉积 [25]。Caveolin-1蛋白的特性可以因外部因素而改变，包括氧化应激，抑制caveolin-1会导致内皮功能障碍，引起肺动脉高压，增加肺动脉血栓形成的风险 [22] [23] [24]。

2) PAR受体家族有四个成员。PAR-1、3、4，都可以被凝血酶激活，凝血酶与肺动脉内皮上的PAR受体结合可产生多种作用：血栓形成、血管通透性增加、炎症细胞因子分泌、趋化剂和粘附分子，增加血小板聚集和前胶原蛋白产生 [10] [26]。

3) 介导肺动脉稳态的另一个重要因素是内皮细胞上的糖萼层。糖萼的成分之一是蛋白多糖内糖，特异性表达于肺和肾动脉的内皮 [27]。糖萼的破坏导致内皮细胞表面的粘附分子(ICAM-1)和血管细胞粘附分子(VCAM-1)暴露，使得参与血栓形成的白细胞进入。有CT血管造影显示，肺栓塞患者蛋白多糖内糖水平升高与病情严重程度相关 [27]。

4.2. TNFα在肺动脉内皮激活中的作用

在体外实验中，TNFα在24小时内人工诱导培养的肺动脉内皮细胞产生促凝表型。其原理是通过增加ICAM-1的表达，减少内皮细胞蛋白c受体(EPCR)的表达和抑制血栓调节蛋白的分泌。此外，伴随着纤溶酶原激活物抑制物-1 (PAI-1)的上调，还观察到组织纤溶酶原激活剂(tPA)和尿激酶型(uPA)的表达。在临床实践中，有许多情况伴随着促炎细胞因子(如TNFα)的产生，包括术后期、溃疡性结肠炎、损伤、脓毒症等 [10] [28]。

4.3. 缺氧在肺动脉内皮激活中的作用

缺氧可诱导内皮细胞的激活，从而刺激内皮细胞中ROS的分泌和缺氧诱导因子(HIFs) 1、2的产生，随着氧浓度的降低，HIFs在细胞核中积累，并与靶基因启动子或增强子上的缺氧反应元件(HRE)结合，从而激活它们的转录 [14] [15]。HIFs诱导促炎因子和粘附受体的合成，包括ICAM-1、NF-kB、TNFα、白细胞介素-6 (IL-6)、组织因子(TF)和PAI-1，从而促进凝血，HIFs可抑制蛋白S和组织因子通路抑制剂(TFPI)的表达 [29]。在一项实验中表明，HIF1α和HIF2α的分泌不仅存在于血管管腔闭塞的区域，在没有阻塞的相邻节段，也有相同的反应 [29]。有慢性支气管炎合并长期吸烟史的患者，与无慢性支气管炎的吸烟者相比，血管内皮和平滑肌细胞(SMCs)中的HIF1α和血管内皮生长因子(VEGF)显著增加(R = 0.64, P < 0.05) [29] [30] [31]。ROS增加了内皮细胞和单核细胞上TF的表达，灭活蛋白C及其激动剂–血栓凝血蛋白，并促进纤维蛋白原转变为纤维蛋白，增加血栓风险 [14] [15]。在缺氧条件下，线粒体中的氧自由基激活PAR-1和PAR-2受体，引起TF分泌，且肺毛细血管中压力的增加有助于增加线粒体ROS的产生，增加血栓风险 [14] [29]。

4.4. 病毒在PA血栓形成易感性中的潜在作用

病毒可直接破坏细胞、损伤内皮。在存在病毒感染的肺、肾脏的内皮细胞中观察到内皮炎症和水肿的迹象，发现凋亡小体、淋巴细胞、白细胞浸润、血小板等 [32]。在对于新型冠状病毒感染人群的研究者发现，细胞凋亡和焦亡可能在内皮细胞的死亡和炎症的发展中发挥重要作用 [32]。冠状病毒穿透细胞的机制是基于其与血管紧张素转换酶II (ACEII)受体的相互作用，ACE-II在PA内皮细胞上表达，使其成为SARS-CoV-2的靶点 [33]。这可能解释了COVID-19感染中PA血栓的高发，而靶向ACE-II可能有助于减少这一危险的并发症。

5. 结论

临床数据表明，原位肺动脉血栓形成越来越多的进入视野，不同的机制可导致肺动脉中的血栓形成。最常见的起始因素是感染或全身炎症过程。在激活过程中，内皮失去了其抗凝特性，并获得了在血栓形成之前的促凝表型。血流动力学因素影响血管壁的通透性，加速血栓形成。缺氧、血小板、内皮和白细胞的募集、促炎细胞因子水平的上调和粘附分子的分泌，共同触发凝血级联并诱导血栓形成。需要进一步的研究来确定肺动脉血栓形成和肺动脉血栓栓塞这两种疾病的鉴别诊断标准和发病机制的特点，这可能成为开发治疗这些疾病的治疗方法的基础。随着对血栓形成过程的研究，有更多新型的治疗血栓性疾病的药物有待被开发出来。

基金项目

课题：重庆市卫生局科研项目“颈动脉粥样硬化的超声与血管造影的临床应用研究”(2007-B-103)、重庆市卫计委中医药科研项目“参附注射液通过SIRT1通路促进梗死心肌移植细胞存活的机制”(ZY20150244)。

NOTES

^*通讯作者。