FoxM1在肝胆系统恶性肿瘤中的作用及研究进展

The Effect and Research Progress of FoxM1 in Hepatobiliary System Malignant Tumor

摘要: FoxM1 (Forkhead box Protein M1)是一种重要的、具有调节细胞增殖分裂等重要作用的转录因子。在多种肿瘤组织中表达量较正常组织明显增高，并且与肿瘤异质性以及耐药性密切相关。相关研究表明FoxM1可通过促进肿瘤血管生成、调节能量代谢、调控信号转导通路等影响肿瘤细胞的增殖、浸润、转移。本文主要介绍FoxM1在肝胆系统肿瘤中的作用及研究新进展，为临床上肝胆系肿瘤的诊断及治疗提供新的理论依据及新的药物作用靶点。

Abstract: Forkhead box Protein M1 (FoxM1) is an important transcription factor that regulates cell proliferation and division. The expression level in various tumor tissues was significantly higher than that in normal tissues, and was closely related to tumor heterogeneity and drug resistance. Related studies have shown that FoxM1 can affect the proliferation, invasion and metastasis of tumor cells by promoting tumor angiogenesis, regulating energy metabolism and regulating signal transduction pathways. This article mainly introduces the role and new progress of FoxM1 in hepatobiliary system tumors, providing new theoretical basis and new drug targets for clinical diagnosis and treatment of hepatobiliary system tumors.

1. 引言

目前癌症在我国仍然属于高发病率疾病，中国每年新增癌症人数约430万，占全球总的约20%，死亡人数超过280万例 [1]。中国居民死于癌症的比例近40年增加了约14%。肝胆系统肿瘤主要包括肝癌、胆囊癌、胆管癌和胰腺癌，是消化系统中常见的恶性肿瘤，但肝胆系统恶性肿瘤发病隐匿，早期多无明显症状，发现时多已属中晚期，大多失去根治性治疗机会，预后较差。因此，研究分析肿瘤发生发展的分子机制并探寻新的生物标志物，有望为晚期失去手术治疗时机的癌症患者带来新的希望。

2. 研究背景

FoxM1是Forkhead家族的一个转录因子，其广泛参与细胞增殖、分化及凋亡，以及DNA损伤修复、血管生成等过程 [2]，是正常细胞增殖所必需的。最新研究证实FoxM1还参与肿瘤的耐药及肿瘤转移。并且较高的FoxM1表达通常与癌症患者的不良预后有关。因此，抑制FoxM1被认为是一种抗肿瘤策略。国内外的相关研究已经证实，FoxM1在各种人类癌症如卵巢癌、肾癌、胰腺癌、乳腺癌、喉鳞癌、胶质瘤、前列腺癌和胃癌等肿瘤细胞中 [3] 表达量明显增高，并发现高FoxM1与预后呈反比关系。FoxM1在肿瘤中的这种特性越来越受到人们的关注，本文就FoxM1在肝胆系统肿瘤中的最新研究进展作一综述。

3. Foxm1概述

Forkhead Box M1 (FoxM1)是Forkhead家族蛋白的成员之一，在所有增殖的哺乳动物细胞和肿瘤来源的细胞系中普遍表达，共有四个亚型：FoxM1A、B、C和D。FoxM1A主要存在于细胞质中，可抑制细胞的转录过程。FoxM1B可显著增强肿瘤细胞的迁移侵袭能力，FoxM1C是转录激活因子，而FoxM1D可能与肿瘤的转移有关。在人类癌症中过度表达亚型主要是FoxM1B。叉头转录因子(FoxM1)是多种生物活性的重要组成部分，包括调节细胞周期及细胞凋亡，维持纺锤体的功能，而组织再生和细胞代谢过程的任何一个环节的失调都有助于肿瘤的发生 [4]，FoxM1过表达与癌细胞的增殖和致瘤性增加有关，而FoxM1耗竭会降低增殖并抑制肿瘤发生，这表明FoxM1参与了肿瘤的形成、增殖和进展。此外，FoxM1规避了p53对肿瘤细胞的抑制作用。最新研究发现突变或删除p53后的细胞中FoxM1表达量较野生型表达明显增加 [5]，这表明肿瘤细胞中p53失活有可能导致了FoxM1表达量的增加。最近，有研究表明FoxM1调控通路是39种人类恶性肿瘤中18,000例恶性结果的主要预测因子 [6]，恶性实体肿瘤的Meta分析显示，FoxM1过表达的肿瘤患者与FoxM1正常的患者相比，预后更差，生存率更低。证实了FoxM1在癌症中的重要作用。此外，FoxM1同样是许多病毒癌蛋白重要的作用靶点，病毒通过一种病毒诱导肿瘤发生的机制来调节FoxM1的表达，例如，在乙型肝炎病毒(HBV)诱导的肝癌发生中，病毒癌蛋白HBx通过ERK/CREB途径上调FoxM1的表达来促进肝癌细胞的侵袭和转移 [7]。E6癌蛋白通过MZF1/NKX2-1轴增强FoxM1的表达对于HPV感染的口腔癌和肺癌的发生和发展至关重要 [8]。

4. FoxM1与肝胆系统肿瘤

4.1. FoxM1与肝癌

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是肝脏最常见的原发恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的主要原因之一。有报道称FoxM1在正常成人肝脏中不表达 [9]，Mayumi Egawa等 [10] 通过分析79例日本HCC患者肿瘤组织和癌旁非肿瘤组织中FoxM1的表达，肿瘤组织中FoxM1的表达量较邻近非肿瘤组织增加约14倍。FoxM1的表达水平与肝脏疾病的病因无关。与血清AFP值较高、肿瘤体积大、组织学分级差、AJCC/UICC TNM分期相关，此外，其通过使用siRNA或能特异性抑制FoxM1d的抑制剂使肝癌细胞在体外形成球形集落减少。这些发现表明Foxm1表达不仅作为一种预测生物标志物，而且作为HCC的治疗靶点具有普遍的实用价值。先前的研究表明FoxM1的表达与肝癌患者的生存呈负相关 [11]。Sun等 [12] 通过对151例HCC患者的研究发现FoxM1的表达是HCC患者OS的强独立预测因子，相关实验结果还表明FoxM1也可以作为预测肝切除术后Hcc复发和转移的分子标记。Shang等 [13] 通过研究Foxm1在体外糖酵解调节中的作用中发现，FoxM1和GLUT1的表达呈正相关。敲除Fox M1后，GLUT1在不同的HCC细胞系中表达均出现明显下降，免疫组化分析结果显示Fox M1和GLUT1蛋白表达与肿瘤的分化和分期密切相关，虽然研究有一定局限性，但这些结果已能在一定程度上提示FoxM1和GLUT1的过表达在HCC的进展中起重要作用。索拉非尼拥有较强的抗肝癌肿瘤增殖和降低肿瘤侵袭能力的作用，Wei等 [14] 在使用不同剂量索拉非尼处理Foxm1两组不同的细胞系时，两组细胞活力在48 h时均受到明显抑制，细胞的侵袭能力也明显降低，Western blot结果显示索拉非尼显著降低了FoxM1 mRNA和蛋白水平的表达，下调FoxM1可以增加肿瘤细胞对索拉非尼的敏感性，在化疗方案中添加FoxM1抑制剂可减少化疗药物的使用剂量并减少副作用。这些数据表明FoxM1可以成为化疗耐药的新的治疗靶点。Chen等 [15] 通过HCC细胞系SMMC-7721、PLC/PRF/5、Huh7、SK-Hep-1和Hep3B的实验分析研究，CCAT2通过与miR-34a的竞争性相互作用来调节FoxM1的表达。FoxM1和CCAT2之间存在正反馈调节。FoxM1除了作为PI3K-AKT，ATM/P53-E2F和p38-MAPK-MK2的下游靶点参与癌症进展外，还首次发现FoxM1同样可以激活lncRNA CCAT2表达，最终认为CCAT2-FoxM1可能是治疗HCC的新靶点。Hu等 [16] 研究了HEK293T细胞和HepG2、Sk-hep1人肝细胞癌细胞系，认为FoxM1通过与启动子中BS3 (5’-AGATGGAGT-3’)的相互作用而直接调节KIF4A。FoxM1通过KIF4A促进HCC细胞增殖，沉默KIF4A可以使FoxM1对HCC增殖的促进作用得到逆转。最终得出KIF4A是FoxM1的下游靶点的结论。

4.2. FoxM1与胆管癌

胆管癌(cholangiocarcinoma, CCA)是一种可发生于毛细胆管至胆总管的各级胆管的实体肿瘤，是仅次于肝细胞癌(HCC)的第二大常见肝胆系统恶性肿瘤，发病率在逐年增加 [17]，许多慢性感染，如肝吸虫病、病毒性乙型和丙型肝炎以及细菌性化脓性胆管炎，都是胆管癌的危险因素。根据解剖位置分为肝内胆管癌、肝门部胆管癌或远端胆管癌。癌胚抗原CA-199是用于诊断胆管癌的主要血清生物标志物，一项荟萃分析显示CA-199 > 1000 U/ml与胆管癌明显相关 [18]，手术切除依然是目前最有效的治疗方法。Jiao等 [19] 通过54例患者的标本免疫组化结果显示FoxM1表达与ADAM-17表达显著相关，70%的病例两者表达一致，FoxM1表达量增加可激活ADAM-17，促进细胞增殖。而敲除FoxM1后ADAM-17表达下降，细胞增殖受到抑制，并停留在S期。这可能与S期相关蛋白cyclin a的变化有关，因为cyclin a是在G2期磷酸化和激活FoxM1所必需的。FoxM1过表达的患者复发率高、生存期短。ADAM-17可以激活Pro-TNFa使其转化成具有生物活性的TNFa，活化的TNFa可以通过释放各种细胞因子，从而促进细胞活力和癌症进展，导致细胞增殖和肿瘤生长活性增加，他们认为FoxM1-ADAM-17-TNFa轴可能是未来胆管癌治疗的有效途径。在骨肉瘤中，已证实Avasimibe可以抑制FoxM1/AKR1C1信号 [20]。Gao等 [21] 研究发现Avasimibe体外可以抑制CAA细胞增殖，体内能显著降低QBC939细胞的肿瘤大小，FoxM1能诱导AKR1C1的表达，使AKR1C1在肿瘤细胞中显著增加，通过建立稳定的FoxM1或shFoxM1转染的CCA细胞，发现在RBE细胞中沉默FoxM1会使AKR1C1表达减少，而过表达FoxM1会使AKR1C1表达增加。这表明，FoxM1是诱导AKR1C1表达的部分原因。为进一步证实FoxM1是如何调控AKR1C1的启动子活性的，实验者通过构建PGL3-AKR1C1启动子质粒的方式，转染RBE细胞时其活性在FoxM1b转染的细胞中显著上调，对FoxM1 DNA结合位点进行了突变，发现PGL3-ADAM17突变的启动子活性降低，使用针对FoxM1的特异性抗体的ChIP检测表明，FoxM1直接结合在AKR1C1启动子区域，表明AKR1C1是FoxM1的一个直接转录靶点，从而促进CAA细胞增殖。

Intuyod K等 [22] 从胆管癌对5-FU耐药中发现，5-FU抗性的发展与其靶点胸腺嘧啶合成酶(TYMS)的表达升高有关，FoxM1在CCA细胞中主要在转录水平上调控TYMS的表达。HuCCA细胞对5-FU耐药，是由于FoxM1无法调节TYMS的表达所致，沉默TYMS可使HuCCA细胞对5-FU敏感性增加，5-FU通过形成FdUMP-TYMS复合物的形式，抑制dUMP向dTMP的转化，这导致了dNTP短缺和细胞毒性DNA损伤，ChIP分析证实在CCA细胞中，TYMS是FoxM1的一个直接转录靶点，FoxM1对TYMS的直接转录激活诱导了胆管癌对5-FU化疗的耐药性。

4.3. FoxM1与胆囊癌

胆囊癌(gallbladder carcinoma, GBC)是最常见的胆道肿瘤，也是第五大常见的胃肠道恶性肿瘤，诊断率低，转移率高，生存时间短，平均生存期为6个月，5年生存率约5% [23]，VEGF-A与内皮细胞增殖、分裂、迁移和血管形成有关，Wang等 [24] 通过在SGC-996细胞系中沉默FoxM1后发现VEGF-A蛋白和mRNA表达水平均显著下调，lentil-FoxM1 shRNA转染后，FoxM1蛋白和mRNA表达水平显著降低，侵袭力降低，但转染lentil-FoxM1后VEGF-A的表达显著增加，进一步的荧光素酶检测显示FoxM1是VEGF-A的转录因子。小鼠实验中，转染lentil-FoxM1的小鼠的肿瘤体积和重量均明显大于对照组且肿瘤灶更多。而在FoxM1过表达细胞中敲除VEGF-A可以部分逆转GBC细胞的恶性表型。荧光素酶检测显示FoxM1是VEGF-A的转录因子，FoxM1可促进VEGF的表达，从而影响癌细胞增殖、迁移和侵袭。Tao等 [25] 通过Kaplan-Meier分析显示，FoxM1表达阳性的GBC患者总生存率低于FoxM1表达阴性的患者。下调FoxM1在GBC-SD细胞中的表达可显著抑制细胞活力，Transwell系统检测，抑制FoxM1可显著抑制GBC-SD细胞的侵袭和迁移，评估细胞衰老的β-半乳糖苷酶(SA β-gal)染色实验发现，经FoxM1 siRNA处理的GBC-SD细胞中SA-β-gal染色有约20%呈阳性，明显高于对照组和NC-shRNA组，提示FoxM1的缺失可能参与了GBC细胞的衰老过程。Wang等 [26] 发现GBC组织中H19表达较正常组织增加，miR-342-3p表达量下降，沉默H19后，MiR342-3p表达水平显著增加，H19与miR-3423p表达呈负相关，荧光素酶报告等试验证明H19直接作用并负调控miR-342-3p，然后靶向FoxM1并负调控FoxM1的表达，说明H19可以通过miR-342-3p影响GBC中FoxM1的表达，从而促进细胞增殖和侵袭GBC细胞。

4.4. FoxM1与胰腺癌

胰腺癌(PC)是全球第四大癌症相关死亡疾病，总体5年存活率不到5%，胰腺癌的极低生存率与早期诊断率、转移早和耐药性有极大地关系。Cui等 [27] 的研究发现FoxM1和LDHA在胰腺肿瘤中高表达。FoxM1可以上调LDHA的表达，并提高了LDH活性、乳酸产量和葡萄糖利用率，而FoxM1的低表达则相反。抑制LDHA表达可诱导癌细胞氧化应激并抑制肿瘤生长，进一步的研究表明，FoxM1直接与LDHA启动子区域结合，在转录水平上调控LDHA基因的表达。此外，FoxM1-LDHA信号的升高也增加了胰腺癌细胞的生长和转移。证实了FoxM1通过转录调控LDHA的表达来调节Warburg效应和胰腺癌发生发展。Mao等 [28] 发现转染了ShCSN5的细胞MMP2在mRNA和蛋白水平上均降低，这导致PC的侵袭和转移能力受到明显抑制，上调MMP2可使CSN5下调导致的迁移和侵袭能力得到恢复，而MMP2的敲除则减弱了CSN5上调所引起的PC转移。随着CSN5表达的降低，FoxM1的总表达和核表达均降低。上调FoxM1可使MMP2的mRNA水平提高，并逆转由CSN5下调引起的MMP2表达下降和细胞迁移和侵袭，机制上CSN5直接与FoxM1结合，减少FoxM1泛素化。实验推测CSN5通过激活FoxM1/MMP2轴参与PC的侵袭和转移。Liu等 [29] 建立了三种不同FoxM1水平的PDX模型，发现高表达的FoxM1组对吉西他滨的耐药性更强。Western blotting显示在吉西他滨作用下，FoxM1过表达可抑制Bax的表达，增加Bcl-2的表达以抵抗细胞凋亡。这表明FoxM1通过抑制细胞凋亡降低了胰腺癌对吉西他滨的敏感性。进一步实验发现胰腺癌组织中FoxM1表达与pSTAT1水平呈负相关，干扰素γ可促使STAT1磷酸化，同时干扰素γ能抑制FoxM1的表达，CHIP分析证实pSTAT1结合在FoxM1启动子的位点，干扰素γ/STAT1途径在胰腺癌细胞中直接抑制FoxM1转录，干扰素γ通过STAT1磷酸化来抑制FoxM1，并增加对吉西他滨的敏感性。Song等 [30] 发现胰腺癌组织中UCHL3的高表达与FoxM1的表达水平呈正相关，UCHL3通过调节FoxM1的蛋白酶体降解的方式修饰FoxM1，UCHL3的耗尽以及UCHL3抑制剂TCID显著增加了FoxM1的泛素化，这表明，UCHL3通过去泛素化并稳定FoxM1，从而增强胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。UCHL3的敲除增加了FoxM1的泛素化，从而增加了FoxM1的表达，提高了胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性。确立了UCHL3-FoxM1轴是胰腺癌疾病进展和吉西他滨耐药的关键因素。全等 [31] 研究了154例原发性PDA标本，发现Merlin在肿瘤组织中表达减少，并与肿瘤分期及分化程度呈负相关，恢复Merlin的表达可显著抑制PDA细胞的生长和转移。进一步的研究表明，FoxM1直接与β-catenin结合，Merlin通过促进FoxM1泛素化和随后的降解来减少β-catenin的核转位，是FoxM1表达的负调控因子。FoxM1的敲除降低了β-catenin的核表达，这一作用可被Merlin表达下调部分逆转。这些结果表明FoxM1在介导Merlin表达对Wnt/β-catenin通路的抑制作用中起关键作用。Liu等 [32] 发现PTTG3P在PDAC细胞系中的表达明显高于非恶性细胞系，通过建立PTTG3P过表达和基因敲除细胞系，证实PTTG3P的表达量与肿瘤的迁移能力和侵袭力成正比。小鼠模型实验也发现PTTG3P基因转染可持续促进PANC-1细胞在皮下的生长，而PTTG3P基因的敲除则表现为抑制作用，表明PTTG3P是PDAC细胞增殖、迁移和侵袭所必需的，这种促进作用是由于PTTG3P能促进FoxM1的表达，促进其转录活性。PTTG3P作为FoxM1的下游靶点，竞争性地与miR-132/212-3p结合，而miR-132/212-3p是FoxM1的关键调控因子，可以被PTTG3P海绵化，通过靶向癌基因FoxM1发挥新的抑制作用，PTTG3P沉默显著增加miR-132/212-3p的表达。MiR-132/212-3p过表达抑制PTTG3P的表达，FoxM1表达的增加显著上调PTTG3P启动子的活性，从而形成一个强有力的反馈环来推动PDAC的侵袭性。

5. 总结与展望

肝胆系统肿瘤有发病隐匿、进展快、诊断率低、手术复杂的特点，预后较差。以往的研究已经证明，FoxM1是许多生物过程和组织细胞中的重要调节因子，它的失调可以显著促进肿瘤的发生、进展以及化疗耐药。FoxM1在各种细胞中表达量均不同，癌组织中的表达量较正常细胞明显增加，所以FoxM1这种表达特性使其可以成为一种有价值的生物标志物，为癌症的早期发现和有效治疗提供依据。有学者通过抑制FoxM1或FoxM1的相关调控网络阻止了肿瘤的发展，并提高了肿瘤细胞对抗肿瘤药的敏感性，使FoxM1有望成为未来肿瘤治疗的潜在靶点。在这篇综述中，我们总结了FoxM1在肝胆系统肿瘤中对肿瘤能量代谢、组织浸润及耐药性等的不同生物途径的作用，未来或通过对FoxM1调控的全面了解而为肿瘤的治疗提供新的选择。

基金项目

山东省重点研发计划项目(2018GSF118191)山东省医药卫生发展计划(2017WS321)。

NOTES

^*通讯作者。