芬芥素生物合成研究进展

Research Progress of Fengycin Biosynthesis

摘要: 芬芥素是一类具备优异抗丝状真菌活性的环状脂肽，有望在植物保护、医疗健康、食品防腐等领域发挥重要作用。芬芥素的制备主要依赖于芽孢杆菌的生物合成。介绍了近年来在芬芥素合成途径、芬芥素合成关键基因挖掘、芬芥素合成工程菌的开发等方面取得的新进展，以期为芬芥素的生物合成、生物活性与合成生物学的深入研究提供参考。

Abstract: Fengycin is a kind of cyclic lipopeptides with strong antifungal activity against filamentous fungi, which is expected to play an important role in plant protection, health care, food antisepsis and other fields. The preparation of fengycin mainly depends on the biosynthesis of bacillus species. The recent progress in the synthesis pathway, key gene discovery, and the development of engineering bacteria for fengycin synthesis are reviewed, in order to provide reference for the further study of fengycin biosynthesis, biological activity and synthetic biology.

1. 引言

芬芥素(Fengycin)为一类芽孢杆菌经非核糖体途径特异性合成的环状脂肽分子，结构稳定，含有β-羟基脂肪酸，侧链长度为16~19个碳原子(图1) [1]。芬芥素能够与真菌的细胞膜脂质双分子层及固醇分子发生作用，从而改变细胞膜结构及通透性，显著抑制丝状真菌活性 [2]。有效防治由串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme) [3]、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea) [4]、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani) [5] 等引发的植物病害。芬芥素安全风险低，可抑制谷物、蔬菜储藏过程中发生的霉变，以达到食品保鲜的目 [6]。在医疗领域中，芬芥素被证实能够缓解由真菌引发的人畜局部皮肤感染，并具有一定的抗肿瘤作用 [7]。芬芥素具有低溶血活性，独特的D-氨基酸与环状结构使其与其它抗菌肽相比更不易被肽酶降解，有望成为继达托霉素后一类应用于临床的新型脂肽类抗生素 [8]。芬芥素的应用前景广阔，可在真菌防治领域发挥重要作用。

Figure 1. Chemical structural formula of fengycin

图1. 芬介素的化学结构式

芬芥素的制备主要依赖于菌株的生物合成提取，其结构相对复杂，少有高效化学合成方法的报道 [9]。能够提取获得芬芥素的菌种主要有枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌以及地衣芽孢杆菌等 [10]，但野生型菌种合成芬芥素的水平有限，严重限制了芬芥素的产业化应用。芬芥素的生物合成涉及到多个酶催化组装步骤，调控机制复杂，合成水平提高存在一定难度，这也为底盘菌的改良、“细胞合成工厂”的构建带来了挑战。重点介绍了近年来芽孢杆菌中芬芥素的生物合成途径、调控因子挖掘、发酵条件优化及工程菌株构建等方面的研究进展，为芬芥素的合成、制备及应用研究提供参考。

2. 芬芥素的生物合成途径

在芽孢杆菌中，芬芥素的合成依赖于非核糖体肽合成酶(Non-ribosomal peptide synthases, NRPS)系统(图2) [11]。NRPS的基本骨架为一系列与待合成脂肽氨基酸序列一致的线性重复排列模块，每个模块通常包含三个核心区域，即腺苷基(A)域、肽基载体蛋白(PCP)域和缩合(C)域，分别对应底物识别和激活、转运催化中心及肽的形成过程，最后一个结构域通常为终止(TE)域，组装至该区域时即宣告此模块的合成结束 [12]。第6和第7模块中的C和TE域是NRPS调控芬芥素生产的关键，去除NRPS的第6个模块(Ala/Val)和第7个模块(Pro)可导致芬芥素在整个肽合酶系统中的缺失 [13]。对于第6个模块，C和TE域的缺失导致芬芥素合成受阻，而A域的缺失导致模块跳跃现象。芬芥素的NRPS系统由芬芥素合成酶操纵子，即fenA到fenE (在枯草芽孢杆菌中为ppsA到ppsE)的五个基因编码，其中表达的FenC激活并组装第一及第二位氨基酸，FenB则组装末位氨基酸，FenC同时是芬芥素合成的NRPS启动模块 [14]。芬芥素合成酶的启动子位于FenC转录起始位点上游86 bp处，其中包含一段富含A及T碱基的17 bp上游元件，直接决定了芬芥素启动子活性 [15]。有研究表明，即使上游元件仅发生点突变，芬芥素的合成效率也会显著降低 [16]。FenB位于肽合酶基因簇的C端，可调控芬芥素的生产，释放成熟的芬芥素。当fenB基因被移除时，合成的芬芥素不能被释放 [17]。

Figure 2. Biosynthesis pathway of fengycin

图2. 芬介素的生物合成途径

尽管尚未构建完整的芬芥素合成调控网络，但已有报道证实，内源性因子，如双组分调节因子(ComA/ComP) [18]、sigma A因子和信号蛋白(DegU, DegQ)等 [19] 也可以影响用于芬芥素合成的环脂肽合成酶基因的表达，sigA基因的上调可以增加芬芥素的产量。在低磷条件下，PhoR/PhoP可以通过控制芬芥素合成酶基因的表达来调控芬芥素的生产 [20]。PNPase在芬芥素合成过程中对NRPS的调控也起着重要作用，PNPase的缺失可以促进芬芥素合成酶基因表达的增加，但芬芥素的产量显著下降 [21]。PNPase可能通过以下三条途径控制芬芥素的生产。首先，通过敲除srfA-a来调节srfA的表达水平会导致芬芥素的表达显著下降，而敲除srfA-c则对芬芥素没有影响，因此，PNPase可能通过调控comS和srfA来调控芬芥素的表达 [22]。第二，调节sigB的表达，PNPase活性的丧失导致sigB基因表达水平上调，sigB负向调节芬芥素的产生 [23]。最后是影响DegQ合成，DegQ通过促进芬芥素基因的表达来促进芬芥素的产生PNPase的缺失促进了ComK的表达，ComK负向调节degQ基因的表达从而改变芬芥素的合成水平。

芬介素在芽孢杆菌内的生物合成途径已经较为明晰，但由于芬介素的合成过程同时受到复杂的基因调控网络的作用，明确调控基因种类和功能是十分必要的。随着芬芥素合成机制研究的不断深入，芬芥素的合成调控网络将日渐趋于完整，这将为外源操纵芬芥素的生物合成带来更多可能。

3. 芬芥素生物合成发酵条件

芬芥素的生物合成产量受到培养方式及培养基质等因素的影响。已有研究显示，菌株合成脂肽的效率与发酵条件紧密关联。Pascal等的研究表明，在无泡沫生物反应器中，枯草芽孢杆菌发酵脂肽类成分如芬芥素、表面活性素等的水平有所提高 [24]。Ramkrishna则证实在巨大芽孢杆菌中，单位时间内脂肽的合成量与接种量及发酵过程中的搅拌速率均有关联，且采用先浸没曝气、再表面曝气的方法能够显著增加芬芥素的选择合成倾向性，最高可占总脂肽合成量的71% [25]。Sameh等分析了枯草芽孢杆菌BBG21在不同溶解氧浓度下的发酵脂肽水平，发现体积溶氧系数k_La是控制脂肽合成产率和芬芥素选择性的关键参数，在恰当的供养条件下，即k_La = 0.01 s⁻¹时，芬芥素具备最高的选择性，随着搅拌速度的增加，溶解氧浓度的增大，芬芥素的产量呈现减少的趋势 [26]。也有研究表明，固定化发酵培养有益于获得更高的脂肽产量。Moncef等以Fe²⁺交联聚丙烯固相载体固定莫海威芽孢杆菌A21进行发酵，48 h后芬芥素的产量相比正常摇瓶培养提高了约2.2倍，但实验结果显示，相比发酵48 h进行收集，发酵72 h的产量反而有所下降，这可能是载体系统疏水性增加的缘故 [27]。Iordan设计了一种带搅拌器的旋转盘式生物反应器，以枯草芽孢杆菌ATCC21332为发酵菌种，在旋转速率为30 min⁻¹时，芬芥素的产量达到944 mg/L，脂肽选择性为87.9%。此外，相对于应用无搅拌器的旋转盘式生物反应器发酵系统，芬芥素的产率增加了33% [28]，且改变培养基初始pH值仅会改变菌株的生长速率，对芬芥素的生物合成水平影响有限。由现有研究结果可知，在发酵过程中，溶解氧的动态水平是制约芬芥素生物合成的关键因素。

发酵菌种培养基质的选择也尤为重要。芬芥素的发酵产量主要与培养基中碳源、氮源的选择有关。Philippe等通过改变枯草芽孢杆菌BBG208的培养底物得出以尿素或尿素铵混合物为氮源、甘露醇为碳源可诱导芬芥素合成启动子高表达的结论，研究中应用谷氨酸、牛肉膏或酪蛋白取代尿素作为补充氮源时，发现芬芥素合成启动子的表达活性大幅下降，芬芥素的合成产量显著降低；应用山梨醇、果糖、阿拉伯糖等取代甘露醇作为碳源时，芬芥素的生物合成会受到抑制，以葡萄糖作为碳源时，芬芥素的发酵产量则几乎没有受到影响 [29]。南京农业大学的陆兆新团队比较了不同碳源对解淀粉芽孢杆菌fmb-60的芬芥素生物合成水平影响，结果显示，在果糖、葡萄糖、乳糖、阿拉伯糖、麦芽糖及山梨醇中，果糖作为碳源底物能够最大化的提高芬芥素的发酵产量，在果糖浓度为25 g/L时，检测到芬芥素合成相关调控因子comA、sigma H、degU和degQ的高表达，此时芬芥素的发酵产量达到最高，为392.87 mg/L [30]。Edgardo等发现解淀粉芽孢杆菌MEP₂18的生物量及芬芥素合成水平与发酵底物的碳氮比有关，研究团队分别以果糖、葡萄糖或蔗糖作为碳源，硝酸钾、硝酸铵或氯化铵作为氮源，比较不同组合及不同碳氮比对芬芥素合成水平的影响。研究结果显示，以葡萄糖作为碳源、以硝酸铵作为氮源，且碳氮比为10:1时，芬芥素的合成水平达到最高 [31]。王阶平等通过改变培养基配方对贝莱斯芽孢杆菌的脂肽产量和抑菌活性进行了研究，结果显示培养基成分为蔗糖20 g/L、酵母浸膏20 g/L、牛肉浸膏15 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.6 g/L、FeSO₄·7H₂O 9 mg/L的条件下，芬芥素的发酵产量达918 mg/L [32]。

结合现有研究可知，现有的芬芥素发酵底物的研究仍局限于营养基质中碳、氮源的选择上，且不同发酵菌种的最适培养基质类型有所不同。此外，大量及微量元素、生长因子等在芬芥素的生物合成中是否发挥作用、发挥怎样的作用仍需进一步研究。

4. 芬芥素工程菌的构建研究进展

芬芥素的合成基因簇序列较长，工程菌的构建难度较大、效率较低，国内外尚无基于编辑芬芥素合成基因簇实现芬芥素工程菌构建的报道。现有芬芥素工程菌的构建思路主要是改变芬芥素合成相关转录调控因子的表达水平，国内外仅有少数研究，且尚无法应用到工业生产中。南京农业大学的李响等应用强启动子P43实现sfp及degQ在不能合成芬芥素的枯草芽孢杆菌168菌株中的表达，液相色谱分析确定168菌株成功合成了芬芥素，且芬芥素合成基因簇中的ppsA-E相对表达量均提高了10倍以上 [33]。通过通过代谢模型分析预测芬芥素合成调控靶点以构建高产工程菌株也是一种思路。有研究基于模型预测获得了accA (编码acetyl-CoA羧化酶)、cypC (编码脂肪酸β-羟化细胞色素P450)和gapA (编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因，并分别构建了芬芥素合成工程菌株，经检测，芬芥素的生物合成产量分别提高了56.4%，46.6%及20.5% [34]。Yazen等通过替换芬芥素合成酶基因簇的启动子，将枯草芽孢杆菌BBG21合成芬芥素的量提高了约10倍，并明确了启动子选择在芬芥素生物合成过程中的重要性 [29]。淮阴工学院的周振等克隆获得了一段与fengycin合成代谢相关的非编码RNA (FenSr3)，将该基因进行敲除后，敲除工程菌株的芬芥素合成产量由190.908 mg/L增加到327.598 mg/L，提高了72% [35]。

在代谢机制了解有限的条件下，应用基因组重排技术能够快速获得理想的工程菌株。陆兆新团队基于基因组重排技术构建了芬芥素合成工程菌株FMB72，芬芥素合成水平相比原始菌株提高了8.3倍，其中fenA基因表达水平上调了12.77倍 [36]。遗憾的是，现有研究中尚无更多应用此方法构建芬芥素合成工程菌株的报道，同时，以此获得的工程菌株传代时遗传稳定性和生物合成水平是否会发生改变仍然未知。限制工程菌株开发的另一因素是，由于无合适的底盘菌株，芬芥素只能依托芽孢杆菌属菌种进行合成，相对于大肠杆菌等模式菌株，进行遗传改造的难度更大。

总体来看，现有的芬介素工程菌株的构建目的仍然是对部分调控芬介素合成的功能基因进行研究，产量低、遗传稳定性差是工程菌株构建过程中面对的主要问题。芬芥素的工程菌株构建研究仍然处于起步阶段，距离工业化应用仍然有着遥远的距离。

5. 展望

芬芥素有望在农业、医疗及食品安全行业发挥重要功能，但受限于其复杂的生物合成系统，芬芥素工程菌构建难度大、成本高、稳定性差、选择性较弱，工业化生产成本过高、得率低，难以实现市场化应用。随着芬芥素合成原理的明晰、合成生物学的发展及长片段基因簇编辑技术的成熟，实现脂肽合成底盘菌株的基因组精简优化及芬芥素的定向合成，有望助力芬芥素的生物合成产业迈上新的台阶。

基金项目

黑龙江省院所基本应用技术研究专项(2021JBKY002)。

NOTES

^*通讯作者。