RNA m5C甲基化修饰及其检测技术在肿瘤中的研究进展

Research Progress of RNA m5C Methylation Modification and Its Detection Technology in Tumors

摘要: RNA甲基化修饰作为转录后修饰的重要组成部分，主要包括N6-甲基腺苷(m6A)、5-甲基胞嘧啶(m5C)、N1-甲基腺苷(m1A)三种修饰类型。以RNA亚硫酸氢盐测序(RNA-BisSeq)为代表的单碱基分辨率检测技术的发展推动了RNA m5C甲基化修饰的研究。由甲基转移酶、去甲基化酶以及甲基化识别蛋白三个主要成分构成的RNA m5C甲基化修饰调控网络，参与包括肿瘤在内的多种疾病的发生发展。本文综述了RNA甲基化修饰的类型、m5C甲基化检测技术的分类与进展及m5C动态调控网络参与肿瘤发生发展的最新研究进展，旨在为以RNA m5C调控网络为靶点的肿瘤治疗方案提供新思路。

Abstract: As an important part of post transcriptional modification, RNA methylation mainly includes N6-methyladenosine (m6A), 5-methylcytosine (m5C) and N1-methyladenosine (m1A). The devel-opment of single base resolution detection technology represented by RNA-BisSeq has promoted the research of RNA m5C methylation modification. The regulatory network of RNA m5C methyla-tion modification, which is composed of methyltransferase, demethylase and methylation recogni-tion protein, is involved in the occurrence and development of a variety of diseases, including tu-mors. This paper reviews the types of RNA methylation modification, the classification and progress of m5C methylation detection technology and the latest research progress of dynamic regulatory network involved in tumorigenesis and development, in order to provide new ideas for tumor treatment targeting RNA m5C regulatory network.

1. 引言

核苷酸甲基化修饰作为表观遗传调控的重要组成部分，被证实参与多种基因的表达调控从而影响细胞增殖分化、免疫反应、肿瘤发生等重要生物进程。过去的研究更多地关注丰度较高的m6A修饰，相较之下，受限于检测技术的限制对丰度较低的m5C修饰尤其是发生在RNA水平的m5C的了解较少。与m6A类似，m5C的甲基化水平通过甲基转移酶和去甲基化酶可逆调节，其分子功能主要通过与不同的识别蛋白结合而实现 [1]。近年来随着RNA亚硫酸氢盐测序(RNA-BisSeq)等技术的发展，研究者得以从全转录组水平以单碱基分辨率鉴定RNA m5C修饰位点及水平，为后续m5C甲基化修饰参与肿瘤免疫、肿瘤转移等生物学功能探究以及在癌症诊断和治疗中的潜在临床应用提供了技术支持。大量研究揭示了m5C在RNA加工中的多种分子生物学功能，如帮助mRNA输出、维持RNA稳定性、调控翻译进程等。本文总结了RNA可逆甲基化修饰类型、m5C甲基化检测技术的分类与进展以及RNA m5C动态调控网络参与肿瘤发生发展的最新研究进展，为以RNA m5C调控网络为靶点的肿瘤治疗方案提供新思路。

2. 可逆的RNA甲基化修饰类型

真核生物中存在着广泛的核苷酸修饰，包括甲基化、乙酰化、糖基化等，目前有超过100种发生在RNA水平上的修饰，而RNA甲基化修饰约占所有RNA修饰的60%，并广泛分布于各种类型的RNA中 [2]。主要包括N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)修饰，5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, m5C)修饰以及N1-甲基腺苷(N1-methyladenosine, m1A)修饰三种类型。

2.1. N6-甲基腺苷

m6A修饰是RNA中丰度最高甲基化修饰类型，约占RNA甲基化修饰的80%，已被证实受到m6A修饰调节的RNA类别包括mRNA、lncRNA、rRNA和miRNA [3]。在m6A甲基转移酶复合物的作用下由S-腺苷基甲硫氨酸(SAM)提供的甲基取代腺嘌呤第6位氮原子所连接的氢，形成N6-甲基腺苷。m6A修饰现已被确定与许多生物过程和疾病密切相关，如RNA代谢相关的基因表达调节、DNA损伤修复、细胞发育和分化、细胞周期、免疫反应，以及参与癌症的进展 [4]。

2.2. 5-甲基胞嘧啶

m5C修饰在DNA中非常常见，但因为其丰度较低，在RNA中的m5C并没有得到足够的重视。但随着高通量测序方法的发展，m5C被确定广泛分布在各种RNA亚型中，包括tRNA、rRNA、mRNA、ncRNA等，并执行多种功能 [5]。m5C修饰主要集中于CpG岛和翻译起始位点下游的区域，在转录组中具有高度保守、组织特异性和动态调控等特征 [6]。催化RNA中m5C修饰的甲基化酶主要是NOL1/NOP2/Sun结构域酶家族(NSUN)以及 tRNA天冬氨酸甲基转移酶1 (TRDMT1) [7]。NSUN家族的主要靶点是tRNA的各种胞嘧啶和mRNA的3'非翻译区。NSUN2作为最著名的NSUN家族成员，可能通过靶向人类鳞状细胞癌和乳腺癌等一系列肿瘤中已知的tRNA，参与细胞周期进程和肿瘤生长 [8]。

2.3. N1-甲基腺苷

m1A修饰已被证实在哺乳动物细胞和组织中具有广泛的转录组分布，其生物学效主要是维持RNA稳定性和参与RNA加工 [9]。最近的研究显示，mRNA上的m1A修饰位点主要富集于翻译起始位点附近，这可能与其促进翻译的启动功能相关 [10]。除了mRNA中的许多靶点外，m1A还存在于tRNA和线粒体基因中，线粒体tRNA中的m1A水平在各种人类癌症中发生显著改变，并与临床预后相关 [11]。但作为mRNA和tRNA中新发现的甲基化修饰类型，其调控网络及生物学功能仍需进一步研究。

3. RNA m5C甲基化修饰的检测方法

早期的研究普遍使用液相色谱–质谱(LC-MS)识别鉴定m5C，但由于其敏感性和可靠性的限制，其对低丰度m5C的识别十分有限 [12]。近年来随着高通量测序技术的发展即各种衍生技术的出现，可以在转录组中很好的识别对包括m5C在内的各种核苷酸甲基化修饰，一些特定的RNA修饰可以基于不同的衍生方法进行精确或相对量化。检测技术的更新极大的推进了转录组表观遗传学的研究进展，为m5C甲基化修饰参与肿瘤免疫、肿瘤转移等生物学功能探究以及在癌症诊断和治疗中的潜在临床应用提供了技术支持。

m5C检测技术的最新发展，包括单碱基分辨率测序：RNA亚硫酸氢盐测序(RNA bisulfite sequencing, RNA-BisSeq)、Tet辅助的过氧钨酸盐氧化测序(TET-Assisted peroxotungstate oxidation sequencing, TAWO-seq)、5-氮杂胞苷介导的RNA免疫沉淀测序(5-azacytidine mediated RNA immunoprecipitation sequencing, AZA-IP-seq)、甲基化单核苷酸交联免疫沉淀测序(methylation individual nucleotide resolution crosslinking and immunoprecipitation sequencing, miCLIP-seq)和基于m5C抗体的测序：m5C RNA免疫沉淀测序(m5C RNA immunoprecipitation sequencing, m5C-RIP-seq)。根据检测原理可将这些技术分为两大类：1) 使用m5C或m5C甲基转移酶特异性抗体进行基于免疫沉淀的测序；2) 使用亚硫酸氢盐或过钨酸盐进行化学依赖性测序。

3.1. 基于免疫沉淀的测序

3.1.1. m5C-RIP-seq

与m6A的甲基化测序类似，m5C-RIP-seq使用特异性识别m5C修饰位点的抗体，与含有m5C位点的RNA片段结合，利用抗体亲和层析富集含有m5C的RNA片段进行文库构建和测序 [13]。虽然m5C-RIP-seq能够很好地识别高甲基化水平的RNA片段，但由于抗体富集的RNA片段长约100~150 nt，与其他单核苷酸分辨率的测序方法相比，峰的分辨率要低得多，并且不能得到m5C在转录组中的精确位置和绝对水平。此外，由于统计分析对覆盖率低的区域相对不敏感，因而m5C RIP-seq无法识别低丰度mRNA上的甲基化。

3.1.2. miCLIP-seq

另一种基于抗体的测序技术，miCLIP-seq，使用针对NSUN2的抗体，而不是m5C抗体，特异性捕获NSUN2靶向RNA片段。由于NSUN2氨基酸序列中271位(C271)的半胱氨酸对甲基化RNA的释放至关重要，Hussain等人通过紫外线交联过度表达的突变NSUN2，以获得具有强共价键的RNA-蛋白质复合物，从而在RT-PCR期间诱导截断或突变。通过在测序数据中识别这些单核苷酸突变或截断，从而定位m5C修饰位点 [14]。目前，通过针对NSUN2的免疫沉淀，Bansal及其同事能够成功地检测RNA中NSUN2介导的m5C修饰 [15]，这也可以应用于其他RNA m5C甲基转移酶。但目前的研究结果表明，NSUN2仅催化部分RNA亚群中的m5C形成，因此使用针对单一RNA m5C甲基转移酶的抗体无法得到全面的转录组学图谱。此外，该技术需要m5C释放结构域突变的NSUN2的过度表达，这将造成异常的细胞内环境并将应用局限与体外培养的细胞 [16]。

3.1.3. AZA-IP-seq

AZA-IP-seq技术通过在细胞生长期间将核苷酸类似物5-氮杂胞苷(5-azaC)引入新合成的RNA中以替换胞嘧啶，利用5-azaC和甲基转移酶之间形成可逆共价键的特性，然后使用甲基转移酶抗体通过免疫沉淀来拉下其靶向RNA [17]。结合高通量测序，来确定精确的m5C位点。然而，5-azaC对培养细胞和动物都具有高毒性，并诱导细胞发生应激反应，可能导致细胞代谢和功能异常。与miCLIP-seq类似，该技术仅能检测针对单一RNA m5C甲基转移酶催化的部分RNA亚群中的m5C位点，得到不全面的转录组学图谱。同时，其检测结果取决于5-azaC的引入效率，导致对低丰度RNA m5C位点的敏感性降低 [18]。

3.2. 化学依赖性测序

3.2.1. RNA-BisSeq

RNA-BisSeq是目前最成熟应用最广泛的RNA m5C甲基化修饰的检测方法。其检测原理依赖于亚硫酸氢盐处理后对非甲基化胞嘧啶的化学脱氨作用，将非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶，并在后续PCR过程中转化为胸腺嘧啶。结合生物信息学分析，通过检测未转化的胞嘧啶来检测m5C修饰位点，同时，还可以通过计算未转化的胞嘧啶比率来估算m5C甲基化水平 [19]。该技术在单核苷酸分辨率和甲基化水平的精确预测方面具有显著优势，且避免了其他技术中的一些缺点，如m5C RIP中对RNA丰度的需求，5-氮杂胞苷在AZA-IP中对细胞功能和代谢的影响，或在miCLIP中突变体NSUN2过度表达。因此，RNA-BisSeq鉴定的体外亚硫酸氢盐处理样品的m5C图谱应反映转录组甲基化的真实状态。该技术的缺陷主要存在于两方面。首先，RNA BisSeq无法很好地区分未转化的胞嘧啶是来自m5C或是5-羟甲基胞嘧啶(hm5C)，尽管hm5C的丰度很低。其次，由于亚硫酸氢盐只能转化单链胞嘧啶，一些未转化的胞嘧啶可能来源于部分RNA形成双链结构引起的不完全胞嘧啶-尿嘧啶转化，由此产生的未转化胞嘧啶将被错误地识别为甲基化胞嘧啶。

3.2.2. TAWO-seq

为了弥补RNA-BisSeq无法区分m5C和hm5C的不足，实现在单碱基分辨率下直接识别m5C和hm5C，研究者开发了TAWO-seq技术，在TET脱甲基酶的作用下先将m5C转化为hm5C，使用过氧钨酸氧化hm5C为三羟基化胸腺嘧啶(thT)，再利用热稳定性II组内含子逆转录酶(TGIRT)在cDNA合成期间将thT转化为T，而原始的hm5C可以用β-葡萄糖基转移酶(β-GT)标记，以防止转化为thT，进而实现m5C与hm5C的区分。以专门检测hm5C修饰位点 [20]。由于TAWO-seq仅将修饰的胞嘧啶(原始m5C)转化为thT，因此大量的常规胞嘧啶不会受到影响，这表明TAWO-seq与RNA0-BisSeq相比，有可能将假阳性问题降至最低。然而，化学转化效率仍然是RNA-BisSeq和TAWO-seq的关键，这将直接影响假阳性率，也是未来技术改进的方向。

4. RNA m5C甲基化调控网络及其在肿瘤中的研究进展

近年来，RNA m5C甲基化修饰被发现与包括肿瘤在内的多种疾病有关，其参与肿瘤发生发展的分子机制以及与临床预后之间的关系受到越来越多的关注。甲基化酶与去甲基化酶共同参与多种RNA m5C的动态调节，m5C修饰位点被下游的甲基化识别蛋白识别并结合最终发挥其生物学功能。阐明复杂调控网络中的分子生物学机制将为临床肿瘤治疗提供潜在的治疗靶点。

4.1. 甲基化酶及其在肿瘤中的研究进展

目前已知有包括NOL1/NOP2/Sun RNA结构域酶家族(NOP2/Sun domain family, NSUN)、DNA甲基转移酶2 (DNA methyltransferase-2, DNMT2)在内的10余种甲基转移酶参与RNA m5C修饰。这些酶利用SAM作为甲基供体催化RNA的m5C修饰。虽然大多数RNA甲基转移酶已被证明在rRNA，tRNA，线粒体tRNA和增强子RNA的甲基化中发挥作用，但在mRNAs、miRNAs和tRNAs的甲基化中发挥主要作用的是NSUN2 [21]。RNA甲基转移酶的异常表达，在癌症的发展和发病机制中发挥重要作用。已有研究表明，在肺鳞状细胞癌患者中NSUN酶家族的异常表达与患者的临床病理特征及生存率相关，并参与调节肿瘤免疫微环境 [22]。DNMT3A的表达水平与胰腺癌患者的临床分级显著相关，其低表达与患者的不良预后相关 [23]。

甲基化酶参与肿瘤发生发展的分子作机制表现出组织和环境依赖性，在不同的肿瘤类型中显示出不同的RNA底物偏好，但表现出一致的致癌倾向。tRNA是NSUN酶家族的主要作用靶点。小鼠肿瘤细胞中NSUN2的缺失导致tRNA的低甲基化水平，并造成tRNA对血管生成素的敏感性增加，从而导致tRNA片段化的累积 [24]。片段化的tRNA在肿瘤中的异常增加中可能表明其在肿瘤发生发展中具有重要的调节功能，但目前对其功能的理解仍处于起步阶段。有研究表明，tRNA的5'片段可以通过调节翻译起始因子与翻译起始复合物的结合来调控翻译的进程，有利于细胞启动应激反应 [25]。在NSUN2缺乏的小鼠肿瘤细胞中，核糖体分析数据也显示与应激反应途径相关的基因翻译增加，NSUN2的缺乏使肿瘤干细胞处于自我更新所必需的未分化状态并引起其对应激的敏感性增加 [26]。同时，NSUN2缺陷的皮肤肿瘤干细胞对5-氟尿嘧啶和顺铂等化疗药物更加敏感，而使用血管生成素抑制剂处理后可降低其对化疗药物的敏感性，将NSUN2抑制剂等片段化tRNA生成增强剂与化疗药物联合运用，可增强对肿瘤干细胞杀伤作用 [27]。这些研究表明，肿瘤干细胞与肿瘤细胞需要严格控制tRNA甲基化水平及片段化tRNA的累积，以调节对应激的应答和维持肿瘤体积。而tRNA甲基化抑制剂作为有效的肿瘤干细胞对化疗药物的增敏剂，其与多种化疗药物的联用将为肿瘤化疗开辟新的道路。在NSUN2敲除的小鼠模型中，DNMT2的缺失通过降低tRNA甲基化水平导致翻译保真度降低从而影响特定的mRNA [28]。这对tRNA修饰参与对细胞增值和分化的影响提供了更多的支持。目前甲基化酶缺失导致的tRNA片段化增加造成的潜在生物学影响仍然完全未被探索，还需要更深入的研究去阐明tRNA片段丰度对肿瘤细胞表型的影响。

在许多研究中，NSUN2的过度表达被证明可以通过调控抑癌基因或原癌基因单一转录本的命运，从而促进增殖 [29]。一项研究显示，NSUN2介导的原癌基因–肝素结合生长因子(heparin binding growth factor, HDGF)的mRNA 3'UTR处异常甲基化可通过与YBX1相互作用增加其稳定性 [30]。但目前仍无法明确NSUN2在肿瘤发生发展中的潜在作用是否由mRNA修饰介导。

4.2. 去甲基化酶及其在肿瘤中的研究进展

可逆的甲基化修饰是动态调节的基础，目前对m5C甲基转移酶已有广泛研究，但对去甲基化酶的分类及定义仍有争论。TET家族蛋白，包括TET1、TET2和TET3，最初被鉴定为DNA双加氧酶。Fu等人的研究发现TETs也可以作为RNA去甲基酶发挥作用，TETs在α-酮戊二ƒ酸及铁离子的协同下催化m5C转化为hm5C，hm5C作为m5C去甲基化过程中的中间体，其进`一步被TETs转化为5-氟胞嘧啶(5-fC)和5-羧基胞嘧啶(5-caC)，最后通过碱基切除修复途径(BER)最终将该位点转化为胞嘧啶 [31]。因为TETs诱导的去甲基化的本质是通过促进后续氧化来取代修饰，所以对TETs的“m5C清除剂”的功能定义仍有争议。

hm5C也被发现在多种肿瘤中发生改变，TETs的突变或异常表达与某些恶性肿瘤高度相关。例如，TET2突变与淋巴母细胞白血病和髓系白血病相关 [32]。TET1在胶质母细胞瘤中表达上调 [33]，而TET3在胶质瘤中的表达受到表观遗传学修饰的抑制 [34]。虽然去甲基化酶参与肿瘤进程普遍被认为与DNA去甲基化或羟甲基化异常有关，但TETs也被证明会将RNA中的m5C氧化为hm5C，这表明去甲基化酶也可能通过调节RNA的去甲基化过程从而调控肿瘤的进程。

4.3. 甲基化识别蛋白及其在肿瘤中的研究进展

RNA发生m5C修饰后的生物学功能实现，需要甲基化识别蛋白特异性地识别并结合到修饰位点，引发后续的生物进程调节。ALYREF是第一个在细胞核中识别出的mRNA m5C识别蛋白，其的活性受到靶mRNA甲基化状态的影响，作为mRNA出口蛋白复合物的一部分参与mRNA由胞核向胞质的运输 [35]。在HeLa细胞中敲除ALYREF导致m5C修饰的mRNA在胞核中保留增加，这表明m5C介导的mRNA输出依赖于ALYREF [33]。与ALYREF不同，YBX1被鉴定为胞质中的mRNA m5C识别蛋白，通过YBX1冷休克结构域中的残基Trp45识别和结合m5C修饰的mRNA [36]。

有研究发现17号染色体上ALYREF基因的异常拷贝与神经母细胞瘤患者的MYCN富集相关 [37]。另一项研究表明，ALYREF与丙酮酸激酶同工酶M2 (PKM2) mRNA的m5C修饰位点结合稳定其mRNA，通过PKM2介导的糖酵解促进膀胱癌细胞增殖 [38]。但目前仍无研究表明ALYREF通过其识别m5C修饰位点参与mRNA转运的功能参与癌症进展。

5. 总结与展望

m5C作为三种RNA甲基化修饰中丰度较低的类型，在检测技术的进步下其修饰位点已被鉴定广泛存在于多种核苷酸分子上，最新的TAWO-seq技术已能在单碱基分辨率下区分m5C和hm5C，但其检测能力仍受限于过钨酸盐的氧化效率，同时β-GT对原始hm5C的标记效率也会影响其假阳性率。我们仍在期待方法学的进步为研究者带来更精确全面的转录组m5C修饰图谱。

m5C动态调控网络中复杂的分子生物学机制，参与人类肿瘤的发生、增殖、转移等生物进程。鉴于RNA m5C修饰展现出的多肿瘤相关性，通过修改关键RNA m5C甲基化酶(如NSUN2)的基因序列，从而减少RNA甲基化水平以干预肿瘤进展的基因治疗具有一定的前景。但考虑到基因治疗的非特异性，基于分子机制开发特异的抑制剂以降低特定RNA m5C甲基化酶的活性并逆转肿瘤的进展，具有更好的安全性。抑制m6A甲基化酶的药物已用于癌症治疗。而目前尚未开发出特异性靶向 RNA m5C甲基转移酶的抑制剂。但有研究表明，现有的使用胞嘧啶化学类似物用于干扰DNA m5C的几种药物，其同样可能会干扰RNA甲基化 [39]。Lyko等人的研究中，用氮杂胞苷可有效降低肿瘤细胞中DNMT2介导的tRNA m5C修饰水平，并抑制肿瘤细胞的增殖 [40]。但这类药物潜在的非选择性影响多个靶点的甲基化，具有潜在的未知风险。此外，影响RNA m5C调控网络的上游分子也是具有潜力的治疗靶点。例如，极光激酶B可调控NSUN2的磷酸化并降低RNA甲基化水平 [41]。为了全面了解RNA m5C修饰在肿瘤发生发展中的功能并开发其靶向药物应用于临床治疗，仍需要对其修饰位点和功能途径进行更多的研究。

NOTES

^*通讯作者。