1. 引言
游泳池是人们娱乐和健身的重要公共场所，如果其水质卫生状况不良，就可能引发多种传染病的传播流行 [1]。韦永孜等 [2] 曾报道南宁市一起因污染的游泳池水引发儿童腺病毒呼吸道感染暴发流行；徐亚萍等 [3] 报道宁波市一家小学游泳池引起多名小学生痢疾和急性结膜炎，说明我国游泳池水的消毒方法不够成熟，对某些病原菌杀灭不彻底，相关部门监测力度不够。美、英等国外游泳池水质标准对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等的检出都做了严格规定 [4]，而我国游泳池卫生标准仅规定了细菌总数和大肠菌群两项微生物学指标。为了解攀枝花市游泳池水中葡萄球菌的污染状况，本研究对该市几家游泳池水进行了抽样检测分析，分离出一株沃氏葡萄球菌，并对其进行了耐药性分析，以便有效控制介水传染病。
2. 材料与方法
2.1. 调查和采集水样
首先于2018年4月下旬对攀枝花市几家游泳馆各项指标展开调查，然后按照我国GB/T 5750.2-2006《生活饮用水标准检验方法——水样的采集与保存》 [5]，并参照我国GB/T 18204.6-2013《公共场所卫生检验方法》 [6] 进行水样采集。将玻璃容器用自来水和洗涤剂洗涤，并用自来水彻底冲洗后用质量分数为10%的盐酸溶液浸泡过夜，然后依次用自来水，蒸馏水洗净。采样瓶在灭菌前加入足量的质量分数10% (m/m)的硫代硫酸钠溶液，125 ml加入0.1 ml，高压蒸汽灭菌15 min备用。采用对角线布点法(图1)，在距离泳池壁1 m远处，水面下约30 cm处，每池取5个点，混合成一瓶，共500 ml，裹好包装纸，冰袋冷藏，4 h内送实验室检测(其中余氯、尿素、水温和pH值进行现场检测)。
2.2. 葡萄球菌分离培养
吸取25 ml水样至盛有225 ml 7.5%氯化钠肉汤(广东环凯微生物科技有限公司，H0056Y)的无菌锥形瓶中，振荡混匀。将上述样品均液于36℃ ± 1℃培养18~24 h。将上述培养物，采用平板划线法分别接种
到Baird-Parker (BP)平板(广东环凯微生物科技有限公司，H0150Y)和血平板(广东环凯微生物科技有限公司，H0144Y)，血平板36℃ ± 1℃培养18~24 h，BP平板36℃ ± 1℃培养18~24 h或45~48 h。观察菌落形态，挑取疑似菌落革兰染色镜检，并进一步用血平板分离纯化培养。
2.3. 血浆凝固酶试验
挑取BP平板或血平板上的纯培养菌落1个或1个以上，分别接种到5 ml BHI (脑心浸出液肉汤) (广东环凯微生物科技有限公司，1068851)，36℃ ± 1℃培养18~24 h。取冻干兔血浆(广东环凯微生物科技有限公司，6104262) 0.5 ml，放入小试管中，再加入BHI培养物0.2~0.3 ml，振荡摇匀，置36℃ ± 1℃温箱内，每半小时观察一次，观察6 h。如呈现凝固(即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块)或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果，否则为阴性。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株(来自攀枝花学院附属医院)的肉汤培养物作为对照。
2.4. Vitek2菌株生化鉴定与药敏试验
将上述初步鉴定的葡萄球菌的血平板纯培养物送攀枝花市中心医院，采用Vitek2 compact全自动微生物鉴定和药敏分析系统(法国梅里埃公司，VK2C6661)进行菌株鉴定和药敏分析；判定标准参照临床实验室标准化协会(CLSI) 2014版标准。
2.5. 数据分析
用WHONET 5.6软件对MIC值药敏结果进行数据处理和分析。
3. 结果
3.1. 调查情况
对几家游泳馆分别进行管理状况调查、水质情况监测和采集水样，其中一家游泳馆后来分离出沃氏葡萄球菌，该游泳馆当时的调查结果(表1)显示浸脚池余氯、尿素、水温不在正常范围，强制淋浴执行力一般，过滤系统清洁周期较长，细菌总数和大肠菌群数均超标。
Table 1. Comprehensive survey of a swimming pool
表1. 某游泳馆综合情况调查
注：根据《游泳场所卫生标准》(GB9667-1996)的人工游泳池水质卫生标准值，游泳池水余氯：0.3~0.5 mg/L；浸脚池水余氯：5~10 mg/L，4 h换一次；尿素：≤3.5 mg/L；池水温度：22℃~26℃；pH值：6.8~8.5；细菌总数：≤1000个/ml；大肠菌群数 ≤ 18个/L。
3.2. 菌株形态特征
在BP平板上，菌落直径为2~3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度(图2)。BP平板为葡萄球菌的选择培养基，从上述生长现象，初步判断细菌为葡萄球菌。后又经血平板培养和革兰氏染色后进一步鉴定为葡萄球菌。
Figure 2. Growth of bacteria on BP plate
图2. 细菌在BP平板上的生长现象
3.3. 血浆凝固酶试验结果
经过6 h的观察，盛有血浆和葡萄球菌BHI培养物的试管未呈现凝固，判定为凝固酶阴性葡萄球菌。
3.4. 生化鉴定
上述分离细菌生化编码为010006002261231，判定为沃氏葡萄球菌(可能性为98%)，具体生化鉴定结果见表2。
Table 2. Biochemical identification results of isolated strains
表2. 分离菌株的生化鉴定结果
3.5. 药敏试验结果
试验选取的17种抗菌药物分属13类：喹诺酮类3种，青霉素类2种，四环素类2种，磺胺类、链阳性菌素类、噁唑烷酮类、头孢菌素类、林可酰胺类、利福霉素类、呋喃类、多肽类、氨基糖苷类、大环内酯类各1种。沃氏葡萄球菌的药敏结果表明，沃氏葡萄球菌诱导性克林霉素耐药为阳性，对克林霉素、红霉素均耐药，但对其它类型的抗生素均敏感。头孢菌素类抗生素头孢西丁筛选结果为阴性，对甲氧西林敏感。具体药敏试验结果见表3。
Table 3. Drug sensitivity test results
表3. 药敏试验结果
注：S，敏感；R，耐药。
4. 讨论
沃氏葡萄球菌是葡萄球菌属中的一员，主要分布在环境及人与动物的皮肤粘膜上，目前多认为其致病性较弱或仅为条件致病菌，所以相关研究相对较少，但近年来偶尔也会在患者、动物或环境标本中检测出来。如叶金奶等 [7] 在平阳县人工游泳池水中也曾检测出过沃氏葡萄球菌；匡雪等 [8] 从外观健康猪的新鲜粪便中分离出一株沃氏葡萄球菌并对其耐药性进行了分析，作者建议由于人与猪密切相关，应加强猪源细菌的耐药性监测；魏超 [9]、马晓燕 [10]、宛传丹 [11] 等分别从牦牛乳中、肿瘤患者中心静脉导管及前列腺炎患者中分离出沃氏葡萄球菌，还有其它学者从骨髓、儿童菌血症的血液、女性乳腺炎患者的脓液、牙膏、患病的罗非鱼苗中分离出此菌 [12] [13] [14]。以上资料均表明沃氏葡萄球菌仍与某些疾病相关，虽然其健康风险相对较低，但也不应该被完全忽视。
本试验采用葡萄球菌的BP选择性培养基从攀枝花市某游泳池水中分离到一株沃氏葡萄球菌，而且细菌总数和大肠菌群数均超标，现结合前面的调查结果分析其原因及引起感染的可能性。首先，池水余氯合格，但细菌总数和大肠菌群数不合格，可能由于投加的消毒剂时间太短，消毒时间不够；也可能是氯胺类消毒剂二氯异氰尿酸钠，在产生次氯酸发挥消毒作用的同时又产生了氰尿酸，形成了氯锁现象 [15]，此时即使有很高浓度的氯，也不能发挥其消毒作用，导致细菌数量在水中超标。其次，浸脚池余氯含量低于标准范围，可能是游泳池管理员未按规定及时给浸脚池补药或换水，余氯低起不到应有的杀菌效果，或者游泳馆淋浴管理不严格，游泳者进入泳池前没有进行淋浴，都有机会将细菌带入泳池。再次，游泳池水温偏高，可能是游泳馆为了招揽生意，迎合客人的舒适感受有关，但过高的池水温度会造成水中游离性余氯挥发加快，难以有效杀死各种微生物。最后，尿素超标，游泳池水中尿素主要来自人体的汗液、尿液等分泌物和排泄物，超标原因可能是游泳者没有进行淋浴直接进入游泳池；儿童自控能力较差，不自觉在水中排尿；也可能因为我们调查的时间是4月下旬，气温不高，游泳的人不是很多，商家为了节约成本，过滤系统清洁周期过长，使水中尿素蓄积，池水受到污染。过高的尿素中的氨会与含氯消毒剂形成氯胺类物质，刺激皮肤、眼角膜、腐蚀头皮等，或者游泳者本身就存在轻微伤口，如果此时水体中有细菌，人体就会增加感染的可能性。
试验分离的沃氏葡萄球菌为凝固酶阴性(Coagulase-negative Staphylococcus, CNS)的葡萄球菌，有报道目前临床分离的凝固酶阴性的葡萄球菌耐药性日益严重 [16] [17] [18]，本实验药敏结果显示，沃氏葡萄球菌对甲氧西林敏感，对克林霉素和红霉素耐药，但对其它类型的抗生素均敏感。由于耐药基因可以在细菌之间传递，沃氏葡萄球菌作为耐药基因库，也有可能将耐药基因传递给其它细菌，加重临床治疗的难度，因此，有必要对外环境中分离的菌株进行耐药性监测，以判断耐药菌的分布情况，遏制和降低细菌耐药现象的产生和扩散。
与国外游泳池水质卫生标准对比 [4]，我国的游泳池水质标准微生物学指标较单一，仅规定了细菌总数和大肠菌群两项，这不能很好地反映池水受污染的情况，建议我国游泳池卫生标准再次修订时，应进一步加强微生物检测指标及标准限值的制定。如将对消毒剂有较强耐受性的葡萄球菌作为池水污染状况监测的基本指标；相关部门应该加大监测力度，督促游泳馆合理有效使用消毒剂，定期进行池壁的清洗和换水，加强对浸脚池余氯检测和泡脚的监督，强制淋浴的执行；设置水温自动控制系统；在游泳池水质检测时，监测氰尿酸等的量，发现超标及时采取相应措施；对那些不合格的游泳馆应加大惩罚力度，监督其改善池水的质量，保障游泳者的身体健康。
基金项目
攀枝花学院大学生创新创业训练计划项目，编号：2016cxcy182。