肾纤维化Wnt/β-Catenin、Hedgehog、Klotho信号通路的最新研究进展

Recent Advances in Wnt/β-Catenin, Hedgehog and Klotho Signaling Pathways in Renal Fibrosis

摘要: 肾纤维化是指肾脏在各种原发或继发因素下导致其功能损伤、结构改变，逐渐出现肾小球、血管及间质纤维基质沉积增加，最终导致慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)及终末肾衰竭。为了给纤维化诊治提供新的理论依据，作者就肾纤维化信号通路及其最新致病机制进行综述。

Abstract: Renal fibrosis refers to the kidney in a variety of primary or secondary factors leading to functional damage, structural changes, the gradual increase in glomerular, vascular and interstitial deposition of fibrous matrix, the result is chronic kidney disease (CKD) and end-stage chronic kidney disease failure. In order to provide a new theoretical basis for the diagnosis and treatment of renal fibrosis, the author reviews the signal pathway of renal fibrosis and its latest pathogenesis.

1. 前言

CKD是各种肾脏疾病发展的最终归路，我国常见的成人CKD发病率为13.4% [1]，据统计CKD发病率还在不断提高，每年高达7%以上 [2]。肾纤维化是各种CKD发展的最终信号通路及主要的病理过程之一 [3]。目前已知的肾纤维化信号通路有Wnt/β-catenin、Hedgehog、Klotho等，本文通过对上述机制进行总结，为理解肾纤维化的发病过程提供了完善的理论基础。

2. Wnt/β-Catenin信号通路在肾纤维化中的作用

2.1. Wnt/β-Catenin信号通路的起源及机制

Wnt1基因初始命名Int-1，来源于小鼠乳腺肿瘤的整合酶-1，1982年被Nusse和Varmus发现。随后研究发现变异果蝇无翼基因(Wingless, wg)与其同源，这两个基因功能相似，研究人员将这两个术语合并为Wnt基因，该信号通路被称为Wnt信号通路 [4] [5]。β-Catenin最早发现是一种粘附因子，由781个氨基酸组成，其核心结构为12个重复序列(第138-664个残基)，以及固有的N-末端和C-末端区域 [6]。随着研究的深入，发现β-Catenin是一种多功能蛋白，在多种发育和稳态过程中起着至关重要的作用 [7]。β-catenin蛋白是钙粘蛋白-E的相关细胞黏附分子，也是经典Wnt信号进入细胞核的重要转录因子。故两者合称Wnt/β-catenin信号通路 [8]。

Wnt/β-catenin信号通路分为经典和其他两类。1) 经典的Wnt信号通路。Wnt通路激活是指Wnt配体与卷曲蛋白(Frizzled, FZD)受体结合，进而与低密度脂蛋白受体相关蛋白5 (low density lipoprotein receptor related protein5, LRP5)和LRP6形成复合体，启动β-catenin蛋白依赖的信号传导。当Wnt与该复合物结合时，支架蛋白(Disheveled, DVL)被募集并防止β-catenin蛋白降解 [9]。随后，β-catenin蛋白积聚以内吞方作用进入细胞核，进行T细胞因子–淋巴增强因子(TCF-LEF)的激活，从而触发Wnt信号通路 [9]。2) 其他Wnt信号通路：包括Wnt/平面细胞极性途径(Wnt/PCP途径)和 Wnt/钙途径(Wnt/Ca²⁺途径) [10]。根据下游效应，所有Wnt配体分为两类：一类是canonical，诱导β-catenin依赖通路的Wnt配体。经典途径激活剂包括Wnt1、2、3、8a、8b、10a和10b，这对于经历结构变化的上皮细胞和间充质细胞之间的定向信息传递和交流非常重要。其他途径包括Wnt4、5a、5b、6、7a、7b和11 [11]。Wnt分子通过与FZD受体和辅助受体LRP5/6相互作用，将细胞内信号传递到细胞内基质中，形成成熟的多泡体来转导Wnt信号。

2.2. Wnt/β-Catenin通路在肾纤维化中的作用

Wnt/β-catenin通路是导致肾脏疾病的关键信号之一。越来越多的研究表明，该通路通过控制与肾纤维化有关的各种下游介质的表达，在促进肾纤维化中起关键作用 [12] [13]。例如，严重的缺血/再灌注损伤导致Wnt/β-catenin持续过度活化，伴有间质肌成纤维细胞活化和细胞外间质沉积，最终导致肾脏发生纤维化 [13]。还有研究发现，在不同肾脏损伤中，发现Wnt/β-catenin表达升高，会使下游信号snail、MMP7表达上升，导致钙粘蛋白-E降低，发生上皮–间充质转化，α-平滑肌蛋白增多，并发生细胞外间质沉积，Ⅰ型胶原、纤维粘连蛋白增多，最终发生肾纤维化 [14]。

2.3. Wnt/β-Catenin通路的最新发现

最新研究发现糖蛋白Dickkopf-3 (Dkk3)通过经典的Wnt/β-catenin蛋白信号通路促进肾纤维化。Dkk3属于调节Wnt信号通路的糖蛋白(DKK1-4)家族，它们由DKK基因编码，该基因包括一个由四个成员(Dkk1-4)和Dkk3相关基因soggy组成 [15]。一些研究表明Dkk蛋白在实验性CKD模型中对Wnt/β-catenin信号传导有显着影响 [16] [17]。费德里科等人 [18] 提供了证据表明Dkk3在发育中的肾脏中表达，在成年期被抑制，并且在病理条件下(即肾组织损伤)新表达。在Dkk3缺陷小鼠中，与单侧输尿管结扎后的野生型小鼠以及腺嘌呤肾病小鼠模型相比，肾小管上皮损伤和肾间质纤维化显着降低。在抗体介导的DKK3阻断后获得了类似的结果。同时，作者观察到Dkk3的肾脏内T淋巴细胞(即主要是Foxp3⁺调节性T细胞和产生γ干扰素的Th1细胞)的积累出现在^−/−小鼠单侧输尿管结扎后。然而，研究发现，通过使用Dkk3fl/FlPax8Cre小鼠，肾小管上皮细胞内Dkk3的遗传缺陷足以预防单侧输尿管结扎后的肾纤维化和肾小管损伤 [19]。这就说明肾小管上皮细胞在肾纤维化过程中起主要作用 [18]。综上所致，Dkk3为肾脏疾病的预后、评估及治疗开辟了新径。

3. Hedgehog (Hh)信号通路在肾纤维化中的作用

3.1. Hh信号通路的起源及机制

1980年，Nusslein-Volhard和Wieschaus博士第一次在果蝇中鉴定出Hh信号，接着在三个脊椎动物中发现Hh基因的同源基因，这一信号通路在组织模式、细胞生长以及细胞分化中扮演重要角色 [20]。Hh包括三种配体：Sonic Hedgehog (Shh)，Indian hedgehog (Ihh)和desert hedgehog (Dhh)，全是脂质修饰蛋白 [21]。在这三种蛋白中，Shh分布最广，阳性率也最高。在人类组织中，Hh分子通过与Ptch1受体(patchd1基因编码)结合启动信号传递，这导致G蛋白偶联受体样蛋白Smoothened (Smo)激活，并介导Gli蛋白转位至细胞核，从而激活Hh靶基因Gli1、Ptch1、CyclinD1、Myc、Jag2、Bcl2和Snail的表达。在Hh蛋白缺失的情况下，Smo的纤毛定位受到抑制，导致Gli蛋白的失活。在蛋白裂解后，c端缩短的Gli抑制因子与DNA结合，抑制靶基因转录。Gli转录因子对Hh信号的传导起着重要的介导作用，其包括Gli1-3，Gli1仅起激活作用，Gli2和Gli3被认为具有激活和抑制功能 [22]。

3.2. Hh信号通路在肾纤维化中的作用

研究发现，Hh及其相关基因在健康人和小鼠肾脏中的表达水平较低，很难在健康人和小鼠肾脏中检测到。体外研究发现，Shh主要分布在肾小管，以远曲小管多见，足够诱导肌成纤维细胞增殖和纤维化发展 [23]。用Shh体外处理鼠肾成纤维细胞，显示α-平滑肌蛋白表达增加和细胞周期相关基因表达 [24]。在缺血再灌注损伤小鼠模型和阻塞性肾脏病等纤维化小鼠模型中，环巴胺(一种Smo的抑制剂)对Hh信号进行传导抑制，显着减弱了肾纤维化的发展 [25]。过去几年的研究确定了Gli和Gli⁺表达对成纤维细胞在介导Hh信号传导在纤维化进程中起关键作用 [23]。肾纤维化中的肌成纤维细胞表达高水平的Gli⁺，这些Gli⁺细胞在体外和体内也表现出干细胞特性。Gli⁺细胞的基因消融减少了肾纤维化小鼠模型中的肾损伤。这些研究显示，HH信号通路在肾纤维化发展过程中扮演着关键角色，主要机制是上皮细胞分泌Hh配体和肌成纤维细胞上调Gli⁺在肾纤维化中起核心作用 [26]。

3.3. Hedgehog信号通路的最新进展

最新报告指出，胰岛素样生长因子结合蛋白-6 (Insulin-like growth factor-binding protein-6, IGFBP-6)通过Hh信号通路的调节参与细胞发育 [27]，可能在纤维化过程中激活SHh通路中起核心作用 [28]。IGFBP-6是最小的IGFBP，mRNA的相对分子量为25.3KDa，IGFBP-6在肾脏中的蛋白表达水平较高。在糖尿病患者血糖控制不佳时，胰岛素样生长因子-II (Insulin-like growth factor-II，IGF-II)所致IGFBP-6的表达亦会增高，而IGF-II表达增加是糖尿病性肾病过度沉积细胞外基质成分的肾小球基底膜之一 [29]。在这项研究中，我们还发现IGFBP-6升高伴有糖尿病并发症，如肾脏、视网膜病及冠心病，提示这些组织/血管区中IGF作用的抑制升高。IGFBP6的主要功能是抑制IGF-II的抗凋亡来介导糖尿病肾病的凋亡。研究显示，CKD或ESRD的成人和儿童血浆中IGFBP-6的水平均显着上调 [30]。与这些一致的是，肾移植前后和排斥时血浆IGFBP-6的监测表明IGFBP-6指示CKD患者肾功能状态，随着肾功能的下降，IGFBP-6水平显着增加8~25倍 [31]。随着肾脏发育，IGFBP-6在尿中含量逐渐增加，表明它与肾脏发育过程有关。IGFBP-6作为一种促凋亡蛋白，可能通过调节肾细胞的凋亡参与发育和纤维变性 [31]。如在肾脏疾病中，先天性梗阻性尿路病变尤其以间质纤维化为特征，这是继肾梗阻后肾损害的典型征象。在此背景下，IGFBP-6在先天性梗阻性尿路病动物模型的梗阻肾脏中显著上调。

4. Klotho信号通路在肾纤维化中的作用

4.1. Klotho基因的概念

1997年Kuro-o等人 [32] 鉴定的衰老抑制基因被命名为Klotho基因，Klotho蛋白家族由αklotho、βklotho、γklotho三个成员组成，都是单程跨膜蛋白。大量的小鼠实验证实，klotho基因的损伤会加速衰老、导致过早死亡、多器官功能的改变，如生殖腺发育不良、胸腺过早退化、皮肤萎缩、中枢神 经系统减退、异位性钙化、骨矿化不全、肺气肿、听力减退和组织器官纤维化等 [33]。Klotho主要高度表达在肾脏远端肾小管上皮，可以促进肾纤维化。Klotho蛋白分为两类 [34]。1) 跨膜型Klotho蛋白：与成纤维细胞受体(FGF)结合形成复合物，同时作为FGF23的强制性协同受体，参与钙磷代谢调节，造成肾小管损伤，引起肾间质纤维化。2) 分泌型 Klotho蛋白：是一种体液因子，主要作用是调整细胞表面包括离子通道和生长因子受体在内的多种糖蛋白的活性。如与IGF-1受体、Wnt配体和转化生长因子-β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1)受体结合，从而抑制由这些生长因子介导的信号传导。

4.2. Klotho在肾纤维化中的作用

研究表明，Klotho通过多种方式进行肾纤维化的调节。如TGF-β1、Wnt/β-catenin、成纤维细胞生长因子-23 (fibroblast growth factor-23, FGF-23)等信号通路，Shasha Yin等研究发现Klotho是肾纤维化的负调节剂，是治疗肾纤维化相关肾脏疾病的关键靶点 [35]。

4.2.1. 抑制TGF-β1信号通路

研究发现，TGF-β1因子对肾纤维化具有致病作用，与其严重程度呈正相关 [36]。在各种肾脏疾病中，klotho水平降低时TGF-β表达升高，显示两者作用明显相反 [35]。丁华琳等人 [37] 观察发现，在糖尿病肾病中，Klotho蛋白表达降低而TGF-β1的表达会升高。在糖尿病db/bd小鼠模型中，当血清及肾脏组织中TGF-β1升高时Klotho蛋白水平也会降低。刘曼等人 [38] 通过IgA肾病模型发现，随着肾纤维化程度加重，TGF-β1的表达逐渐上调而Klotho的表达受到抑制，另一方面，敲除Klotho基因会进一步加重肾纤维化程度。上述研究证明Klotho通过抑制TGF-β1及其下游信号在抗肾纤维化中起作用。

4.2.2. 抑制Wnt/β-Catenin信号通路

Klotho是Wnt/β-catenin信号传导的内源性拮抗剂。陈燕玲等人 [39] 通过碘普罗胺对肾脏影响研究发现，随着浓度增加，人肾近曲小管上皮细胞Klotho表达显著下调，而Wnt、β-catenin表达明显上升。Qi Wang等人 [40] 在糖尿病肾病中通过蛋白质印迹分析，高血糖刺激下肾小球内皮细胞表达Wnt/β-catenin途径相关蛋白(Wnt1、β-catenin蛋白)水平显著上调，klotho水平下调。基于补充外源性klotho，发现显著消除了高血糖诱导的肾损伤。拜霖楠等人 [41] 实验证明，瘦素通过拮抗Klotho的作用，刺激wnt2b、Wnt5a、Wnt6、Wnt7a的mRNA上调，并能阻遏β-catenin蛋白磷酸化过程，故而启动Wnt/β-catenin信号通路。上述研究表明，Wnt和β-catenin蛋白的作用被Klotho抑制从而使Wnt/β-catenin信号通路失去作用。

4.2.3. 成纤维细胞生长因子-23 (Fibroblast Growth Factor-23, FGF-23)信号通路

在肾脏中，FGF-23的生理功能是通过与其受体(FGFR)及其特定的辅助受体Klotho的结合复合体来实现的 [42]。FGF-23是一种激素，主要产生于成熟成骨细胞和骨细胞。具有维持磷酸盐内环境稳态和抑制1,25-(OH)₂D₃和PTH产生的作用 [43]。FGF-23作用于肾脏的机制：1) 通过抑制肾小管细胞中的II型Na+/Pi依赖性共同转运诱导磷酸尿症；2) 通过增加编码1α-羟化酶的Cyp27b1基因的表达和降低编码24-羟化酶的Cyp24基因的表达来逆向调节维生素D，其中编码1α-羟化酶的酶从其无活性的前体25-(OH)D₃合成1,25-(OH)₂D₃ [44]。结果，在CKD早期，随着血磷升高，FGF-23降低来反向调节磷酸盐升高。随着CKD病程的进展肾小球滤过率逐渐降低，机体自身调节机制紊乱导致血磷酸盐增加及1,25-(OH)2D3减少，而FGF-23持续升高，肾脏Klotho表达减少，导致肾纤维化逐渐加重，不可逆转 [45]。因此，FGF-23被作为是CKD患者早期肾脏损伤的灵敏筛查指标 [46]。

4.2.4. Klotho信号通路最新发现

最新报道，核因子–红2-相关因子2 (Nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)在氧化应激中扮演重要角色 [47]。氧化应激是糖尿病肾病的中心环节，而足细胞在此环节中非常容易受到损伤 [48]。在糖尿病肾病中，Nrf2活化可以改善由高糖引起的氧化应激、纤维变性 [49]。Klotho已被证明是氧化应激的重要调节剂，补充Klotho蛋白可激活db/db小鼠Nrf2信号通路，并抑制了糖尿病诱导的氧化应激和足细胞凋亡，改善肾功能及和减少肾小球硬化。因此，我们推测Klotho的肾脏保护作用可能归因于Nrf2的抗氧化能力 [50]。

从机制上讲，Klotho可以通过促进FoxO3介导超氧化物歧化物2(SOD₂)表达 [51]、增强硫氧还蛋白/过氧还蛋白(Trx/Prx)系统 [52] 或抑制PKCα/p66SHC激活 [53] 来阻遏转录因子Nrf2在氧化应激中的作用，调节细胞氧化还原稳态。Klotho和Nrf2之间的联系已经在使用klotho突变小鼠的研究中确立，Klotho缺陷小鼠的细胞质和核Nrf2水平显着降低，而Klotho过表达小鼠的核水平Nrf2表达和活性增加 [50]。在Lina等人 [50] 的研究中发现，在高糖条件下的足细胞及糖尿病db/db小鼠中，Klotho过度表达激活了足细胞中Nrf2信号传导，从而抑制了足细胞的氧化应激及细胞调亡作用，使用Nrf2抑制剂治疗后显着消除了这种作用。这些结果表明，Nrf2是Klotho赋予足细胞保护的下游效应子，并且Klotho-Nrf2途径可能是对抗氧化应激的常见机制。

5. 结论

肾纤维化是慢性肾脏病常见的病理机制，常见的肾纤维化途径多种多样，本文阐述了Wnt/β-catenin、Hedgehog、Klotho信号通路导致肾纤维化的发病机制及最新研究进展，为完善肾纤维化提供了最新理论支持，也为进一步治疗肾纤维化提供了新思路。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者Email: [e-mail]