长链非编码RNA对心脏成纤维细胞功能的研究进展

Advances in the Study of Long Non-Coding RNA on Cardiac Fibroblast Function

摘要: 心脏成纤维细胞参与心脏各种损伤的修复，可以维持心脏结构和功能的完整。非编码RNA参与许多疾病的进展，已经成为进一步了解成纤维细胞的新方向，其中长链非编码RNAs (Long Non-Coding RNAs, LncRNAs)数量丰富、种类众多，本文总结通过调控心脏成纤维细胞参与心脏重构的长链非编码RNAs，并简述其作用机制。

Abstract: Cardiac fibroblasts are involved in the repair of various cardiac injuries and can maintain the structural and functional integrity of the heart. The involvement of non-coding RNA in the pro-gression of many diseases has become a new direction for further understanding of fibroblasts, among which long non-coding RNAs (LncRNAs) are abundant and diverse. In this paper, we sum-marize the long non-coding RNAs involved in cardiac remodeling through regulation of cardiac fi-broblasts, and briefly describe their mechanisms of action.

1. 概述

蛋白质编码基因的转录和翻译离不开非编码RNA的调控作用，并且它们占据人类全部基因的大部分。其中，长链非编码RNAs (Long Non-Coding RNAs, LncRNAs)和微小RNA (microRNAs, miRNAs)研究较为广泛，它们与多种疾病和病理过程相关，如恶性肿瘤、细胞凋亡等，而在心血管疾病中，它们的调控作用正在不断被发现。心脏成纤维细胞生理状态下可以维持心脏的结构和功能的完整性，它可以在病理状态下被激活，发生一系列反应参与修复过程 [1] [2] [3] ，本文总结分析参与调控心脏成纤维细胞的LncRNAs，旨在增强对成纤维细胞的认识并为更多研究提供参考。

2. 心脏成纤维细胞与心脏纤维化

在心脏组织中主要包括三种细胞：心肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞。对于心脏成纤维细胞的研究集中于心脏纤维化(心脏重构)，心脏纤维化是以心脏细胞外基质过度沉积为主要特点的病理过程，常见于心肌梗死、肥厚型心肌病等，其中心肌梗死后纤维化最为常见。心脏成纤维细胞是心脏纤维化过程的关键细胞，它向肌成纤维细胞转化并分泌胞外基质，产生不同类型的基质金属蛋白酶(MMP)、α-SMA、I型胶原等 [4] [5] [6] 。

广义上成纤维细胞活化(激活/纤维化)包括了其增殖、迁移、分泌胞外基质和转化为肌成纤维细胞(表达收缩蛋白)多种过程 [7] ，很多研究也并未对此做出严格区分。成纤维细胞在不同状态下表达的蛋白也不同，许多研究以检测α-SMA、I型胶原、III型胶原体现成纤维细胞的活化，这些蛋白通常被认为主要由肌成纤维细胞表达，然而其细胞特异性仍缺乏证据 [8] ，同样，基质金属蛋白酶被认为主要由成纤维细胞分泌。

研究发现一些细胞因子、信号通路可以调节心脏成纤维细胞的功能，如巨噬细胞可通过分泌TGF-β1、白细胞介素-16等刺激成纤维细胞增殖，并向肌成纤维细胞转化；TGF-β/Smad信号通路被认为是激活心脏成纤维细胞最有效的调控机制之一。当前对成纤维细胞的研究不再局限于编码蛋白质的基因，越来越多研究表明非编码RNA可以调控成纤维细胞的功能。

3. LncRNAs与心脏成纤维细胞

许多miRNA被发现参与了调控心脏成纤维细胞，而LncRNAs研究成果相对较少，LncRNAs是由超过200个核苷酸组成，可以根据长度、功能、位置和靶向机制进行分类，目前尚无统一的分类标准。LncRNAs对细胞具有多种调节功能，包括基因表达的调节、核质运输等 [9] ，其中对基因表达的调节方式包括：增加或降低靶mRNAs稳定性、促进或抑制靶mRNAs的翻译、作为miRNAs的前体、作为miRNAs的竞争性内源性RNA (ceRNA，又叫海绵样作用)。许多信号通路参与LncRNAs对心脏成纤维细胞的调控，如TGF-β/Smad信号通路，被认为是促进成纤维细胞活化的有效通路 [10] 。本文综述目前发现的对心脏成纤维细胞具有调控作用的LncRNAs，并简要介绍其作用途径。

4. LncRNAs抑制心脏成纤维细胞激活

4.1. LncRNA GAS5：通过抑制miR-21或ALK5抑制心脏成纤维细胞活化

LncRNA GAS5即生长抑制特异性基因5，通过负向调控miR-21及其靶点磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)，抑制COL1A1和α-SMA的表达，抑制心肌成纤维细胞活化。miR-21参与许多器官的促纤维化过程，在给予异丙肾上腺素诱导大鼠心脏纤维化模型的组织标本和TGF-β刺激的大鼠原代心脏成纤维细胞中，LncRNA GAS5均被发现表达下调，而miR-21表达上调，同时Col1A1和α-SMA表达增加。在进一步的验证实验中，过表达LncRNA GAS5显著抑制了miR-21的表达，抑制了心脏成纤维细胞的活化、增殖，沉默LncRNA GAS5具有相反的结果 [11] 。

另有研究表明，LncRNA GAS5抑制ALK5抑制成纤维细胞增殖和心脏纤维化。在房颤患者组织标本检测到LncRNA GAS5表达升高，体外实验发现LncRNA GAS5通过抑制ALK5 (激活素样激酶5)而发挥抗纤维化作用，然而他们体外实验使用的是AC16细胞(人心肌细胞)，仍然缺乏LncRNA GAS5对成纤维细胞作用的直接证据 [12] 。此外，在研究MeCP2 (一种转录抑制因子)抑制LncRNA GAS5而促进心脏成纤维细胞激活时，Hui Tao等人发现LncRNA GAS5的耗尽与Smad3通路相互作用促进了心脏成纤维细胞的激活 [13] 。另有研究发现DNMT1可以通过甲基化作用使LncRNA GAS5在脂多糖诱导的心脏成纤维细胞激活中表达降低，进而通过NLRP 3信号通路导致心肌成纤维细胞焦亡和心肌纤维化 [14] 。

4.2. LncRNA FAF：通过TGFβ1-P-Smad2/3信号抑制心脏成纤维细胞的活化

LncRNA FAF即成纤维细胞生长因子9 (FGF9)相关因子，Sun J等人研究发现，LncRNA FAF通过靶向心脏成纤维细胞中的FGF9通过TGFβ1-P-Smad2/3信号抑制心脏成纤维细胞活化。他们采用慢性灌注AngII诱导小鼠心脏纤维化，发现LncRNA FAF表达降低，在体外过表达LncRNA FAF显著抑制了AngII诱导的成纤维细胞活化。进一步研究机制发现LncRNA FAF抑制纤维化的功能主要是通过其直接标靶FGF9下调Smad2/3的磷酸化，抑制TGFb1-P-Smad2/3信号通路来实现的 [15] 。

此外，细胞焦亡又称细胞炎性坏死，caspase-1是一种焦亡关键因子。在糖尿病心肌病的研究中，干扰LncRNA Kcnq1ot1通过抑制miR-214-3p/caspase-1通路抑制成纤维细胞焦亡 [16] 。LncRNA 1700020I14Rik和LncRNA NRON [17] [18] 也可以抑制心脏成纤维细胞活化过程。

5. LncRNAs促进心脏成纤维细胞激活

既往研究中促进心脏成纤维细胞活化的LncRNAs较多，在此对其中一部分做简要介绍，其他LncRNAs见表1。

Table 1. LncRNAs involved in regulating cardiac fibroblasts and its mechanism

表1. 调节心脏成纤维细胞的LncRNAs及其作用机制

5.1. LncRNA MIAT

LncRNA MIAT即心肌梗死相关转录本(Myocardial Infarction Associated Transcript MIAT；又称GOMAFU27)，可以通过多种机制发挥促纤维化作用。LncRNA MIAT在成纤维细胞中通过海绵样作用抑制miRNA-24，而miRNA-24对其靶基因Furin具有抑制作用，Furin是TGF-β1激活因子，最终结果就是LncRNA MIAT上调促进TGF-β1而促进纤维化。这一结论在敲除LncRNA MIAT的成纤维细胞中也得到验证 [19] 。

在另一项关于房颤的研究中，在大鼠房颤模型发现LncRNA MIAT表达显著增加，miR-133a-3p表达降低，LncRNA MIAT可以抑制mir-133a-3p的表达，抑制LncRNA MIAT可降低纤维化相关基因表达。然而该研究体外实验使用的293T细胞，尽管研究结论与既往研究相同，但未能直接明确在心脏成纤维细胞中对mir-133a-3p的效应 [20] 。同样的，邢佳侬等人在大鼠房颤模型中发现下调LncRNA MIAT可以促进miR-128-3p表达，进而减少炎性细胞因子与促纤维化因子合成，减少房颤大鼠的心肌炎症及纤维化，他们也未使用成纤维细胞进一步体外实验 [21] 。在肥厚型心肌病的纤维化中，LncRNA MIAT可能通过负性调节miR-29a进而调控纤维化发生发展，该研究使用的H9C2大鼠心肌细胞和人横纹肌肉瘤细胞A-204，缺乏在成纤维细胞中的直接证据 [22] 。

此外，在尼古丁刺激的小鼠心脏成纤维细胞中，敲低LncRNA MIAT使miR-29家族增加并降低了细胞外基质蛋白表达，nAChRs可能参与该过程 [23] 。

LncRNA MIAT具有miR-150的结合位点，可作为miR-150的海绵调节细胞增殖、凋亡和迁移，miR-150在多种疾病中对心脏具有保护作用。HOXA4 (homeobox a4，同源盒a4)是一种转录因子，与心肺发育和部分肿瘤发病相关，具有促纤维化作用。miR-150部分通过直接抑制HOXA4进而抑制心脏成纤维细胞激活，对心梗后的心脏重塑起到保护作用，而LncRNA MIAT通过其竞争内源性RNA作用(海绵样作用)阻断了miR-150对HOXA4的抑制而促进成纤维细胞激活 [24] 。

5.2. LncRNA H19

LncRNA H19位于人类染色体端粒区11p15.5位点，长度为2.3 kb，被称为胎儿基因，可以通过多种作用促进成纤维细胞活化。LncRNA H19是作为增殖促进因子还是增殖抑制因子仍有争议，而且LncRNA H19可能在不同的组织类型或发育阶段发挥不同的作用，有研究发现它对心肌细胞缺氧损伤具有保护作用 [25] ，也有研究发现它可以促进心肌细胞衰老 [26] ，而在心脏纤维化过程中，许多研究结果支持其具有促进纤维化的作用。

LncRNA H19通过负调控miR-455影响结缔组织生长因子(CTGF)来促进心肌细胞外基质的积累，增加I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、α-SMA的表达。CTGF是miR-455的靶基因，miR-455抑制纤维相关蛋白的合成，具有抗纤维化作用，而LncRNA H19与miR-455具有互补结合位点，LncRNA H19和miR-455通过CTGF调节成纤维细胞分泌胶原 [27] 。Tao H等人发现，LncRN H19可以通过抑制DUSP5/ERK1/2轴进而促进心脏成纤维细胞增殖和纤维化。双特异性磷酸酶5 (DUSP5)是一种核磷酸酶，调节许多正常生长所必需的细胞功能，如细胞增殖。他们发现在异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌纤维化模型以及TGF-β1诱导激活的心脏成纤维细胞中，LncRNA H19表达水平明显升高，DUSP5蛋白表达下调。过表达LncRNA H19后，DUSP5表达下调，p-ERK1/2上调，促进了成纤维细胞的增殖 [28] 。

LncRNA H19通过YB-1调节心脏重塑，过表达LncRNA H19可以促进成纤维细胞激活，也增加了基质相关基因表达。Y-box结合蛋白1 (YB-1)是一种DNA和RNA结合蛋白，可以抑制心脏成纤维细胞中Col1a1的表达。缺氧条件下在成纤维细胞观察到LncRNA H19了抑制YB-1功能，LncRNA H19与YB-1结合，破坏YB-1与胶原I启动子之间的相互作用。据此提出在心脏重塑的早期阶段，通过抑制LncRNA H19表达或LncRNA H19与YB-1的相互作用可以减轻胶原沉积和心脏重塑 [29] 。

5.3. LncRNA Safe

LncRNA Safe即LncRNA AK137033，Hao K等人发现LncRNA Safe通过Safe-Sfrp2-HuR复合物在小鼠心肌梗死中促进成纤维细胞激活。SAFE-SFRP2-HUR复合物是纤维化的重要调控因子。SFRP2和LncRNA Safe通过RNA-RNA相互作用促进彼此RNA的稳定性。SFRP2通过激活BMP1启动TGF-β进而促进成纤维细胞中COL1A1、α-SMA和BMP1的表达，使成纤维细胞的平均细胞大小和收缩能力显著增加。BMP1是肌成纤维细胞分泌的基质蛋白，可以将前胶原转化为成熟胶原，还可以激活TGF-β，HuR是一种RNA结合蛋白，能够识别并与SAFE-SFRP2 RNA双链体结合并保障其稳定性 [30] 。

5.4. LncRNA TDRG1

LncRNA TDRG1即睾丸发育相关基因1 (TDRG1)，可以通过miR-605-3p/TNFRSF21轴加重TGF-β1诱导的心脏成纤维细胞的纤维化和炎症反应。miR-605-3p在成纤维细胞中发挥抗纤维化和抗炎作用，TNFRSF21作用相反，TNFRSF21在3’-UTR具有miR-605-3p的潜在结合位点。LncRNA TDRG1与miR-605-3p结合阻碍了miR-605-3p对其靶基因TNFRSF21的抑制作用，进而促进成纤维细胞发生炎症和纤维化 [31] 。

5.5. LncRNA PFL

LncRNA PFL即LncRNA NONMMUT022555，Liang H等人发现小鼠体内敲除LncRNA PFL后，减少了梗死部位胶原沉积，改善了小鼠心功能，降低了心脏纤维化相关基因的表达，体外实验具有类似结果。miRNA let-7家族在MI后心脏纤维化中起到保护作用，而Ptafr可以促进纤维化，在Ptafr的3’-UTR中有两个保守的let-7d结合位点，同时，let-7d包含两个PFL结合位点。LncRNA PFL竞争性结合miRNA let-7d促进Ptafr表达，进而促进成纤维细胞增殖和转化。此外，他们在小鼠MI模型中发现了其他差异表达的LncRNA，例如NONMMUT021928和NONMMUT065582，它们也包含有let-7d结合位点，然而未进行相关研究 [32] 。

5.6. LncRNA WISPER

LncRNA WISPER即Wisp2超增强子相关RNA，可以与TIAR结合调控Plod2从而促进心脏成纤维细胞活化，同时它还具有抗凋亡作用。LncRNA WISPER即Wisp2超增强子相关RNA，TIAR即TIA1相关蛋白，通过调节Plod2 (赖氨酰羟化酶2)参与组织纤维化，LncRNA Wisper与TIAR的结合使其能够控制Plod2以原纤维化形式的表达，成纤维细胞中下调LncRNA Wisper降低了TIAR/Plod2相互作用和Plod2表达 [33] 。

此外，LncRNA PVT1即浆细胞瘤变异体易位1 (PVT1)，具有miR-128-3p的结合位点，而miR-128能够靶向与TGF-β1结合并可激活TGF-β1表达的转录因子特异性蛋白1 (Sp1)。Cao F等人发现LncRNA PVT1通过miR-128-3p/Sp1轴促进AngII诱导的成纤维细胞活化和TGF-β1/Smad信号激活 [34] 。Lang M等人发现LncRNA MHRT作为miR-3185的竞争性内源性RNA (ceRNA)发挥作用，miR-3185抑制I型胶原和III型胶原的表达，LncRNA MHRT过表达降低了miR-3185而促进了成纤维细胞分泌胶原 [35] 。其他可以活化成纤维细胞的LncRNAs (LncRNA MEG3、LncRNA Dnm3os、LncRNA HOTAIR、LncRNA LINC00152、Lnc RNA Ang362、LncRNA n379519、LncRNA Cfast、LncRNA LICPAR、Lnc RNA Malat1、LncRNA TUG1、LncRNA XIST [36] - [46] )已在表1中列出，不再赘述。

尽管我们已经发现了不少LncRNAs参与激活或抑制激活心脏成纤维细胞，但有些LncRNAs仅能根据研究结果推测参与了调控成纤维细胞，尚缺乏足够的证据明确和支持它们的作用及机制(如表2)。LncRNA ROR可能通过上调c-myc，提高血清IL-6水平，从而促进心脏成纤维细胞活化。小鼠病毒性心肌炎模型中过表达LncRNA ROR后心脏纤维化程度加重，胶原纤维堆积增多，炎性细胞积累增多，c-myc和TGF-β、IL-6的表达水平升高 [47] 。此研究构建的小鼠病毒性心肌炎模型涉及包括心脏纤维化在内的多种病理过程，同时该研究仅通过体内实验检测相关指标，并未对心脏成纤维细胞进一步完善体外实验，尚无法排除心脏中其他类型细胞对实验结果的影响。Jiang XY等人发现AngII刺激的大鼠心脏成纤维细胞中纤维化相关的几个Lnc RNA，其中AF159100、BC086588和MRNR026574的表达水平上调，而MRAK134679、NR024118和AX765700的表达水平降低。同时，miRNA中Cdkn1c (细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1C)表达降低，AngII对LncRNA NR024118和miRNA Cdkn1c表达的调节具有时间依赖性，提示LncRNA NR024118在成纤维细胞的活化中发挥了潜在作用，而且可能与miRNA Cdkn1c相关 [48] ，但该结论需要更多实验来证明具体效应和机制。

Table 2. LncRNAs may be involved in the regulation of cardiac fibroblasts

表2. 可能参与调控心脏成纤维细胞的LncRNAs

在对缺血性心肌病的研究中，Huang ZP等人发现5个富集于心脏成纤维细胞的LncRNAs：n379599、n379519、n384640、n380433和n410105。随后在体外对其进行敲低，他们发现一些纤维化相关基因表达降低，而过表达这些LncRNAs，纤维化相关基因表达升高，TGF-β信号通路可能这些LncRNA的潜在作用途径 [49] 。LncRNA Chast即心脏肥大相关转录物，Viereck J等人研究发现在小鼠体内LncRNA Chast促进心脏肥大和心脏纤维，对心肌肥大、预测心梗有作用。尽管主动脉缩窄构建心肌肥大的心脏重构模型和体外心肌细胞实验中发现LncRNA Chast可以促进心脏重塑和纤维化，然而检测到LncRNA Chast主要表达于心肌细胞中，在心脏成纤维细胞中的改变并不明显 [50] 。

6. 总结与展望

心脏成纤维细胞活化后主要参与纤维化过程，这可以修复、保护心脏，当这种修复作用超过一定限度后反而对心脏造成损害，从基因方面探究调控心脏纤维化的机制有助于更加精准地把握成纤维细胞参与纤维化的程度，从而提高临床中心血管疾病的疗效和预后。心脏纤维化分为反应性纤维化和修复性纤维化，心肌梗死后，在梗死边缘区和未损伤处以反应性纤维化为主，修复性纤维化和反应性纤维化都是由成纤维细胞和肌成纤维细胞以相似的机制介导的，因此本文对纤维化类型并未详细区分 [5] [6] 。目前研究已经发现许多miRNAs可以调控心脏成纤维细胞，本文主要介绍了一些参与调控心脏成纤维细胞的LncRNAs，可以看出，多数LncRNAs参与成纤维细胞的活化过程，竞争性抑制miRNA和TGF-β/Smad信号通路是其常见的作用途径。然而人体基因中仍有大量的LncRNAs尚不明确，这些LncRNAs的作用机制为以后其他非编码RNAs的研究提供了思路。直接心脏重编程技术旨在诱导心脏成纤维细胞转化为心肌细胞样细胞进而改善心梗后的心脏功能，探究非编码RNAs对这项技术也具有参考价值 [51] 。

基金项目

国际自然科学基金青年基金(81700230)；

山东省自然科学基金(ZR2017LH001)；

济宁医学院贺林院士新医学临床转化工作站科研基金(JYHL2018FZD08)。

参考文献

NOTES

^*通讯作者。