超临界CO₂酶解富集多不饱和脂肪酸研究进展

Research Progress on Eenrichment of Polyunsaturated Fatty Acids by Enzymolysis under Supercritical Carbon Dioxide

摘要: 超临界CO₂脂肪酶酯交换反应是一种新型、绿色、高效的方法，在富集浓缩DHA、EPA等多不饱和脂肪酸方面具有很好的发展前景。本文对目前多不饱和脂肪酸的生产现状、传统酶法及以超临界CO₂流体为介质的非水相脂肪酶法在多不饱和脂肪酸方面的应用进行综述，通过对比传统工艺并结合国内外最新研究进展，探讨超临界CO₂脂肪酶酯交换反应在分离富集不饱和脂肪酸中的优势与应用前景，为相关研究提供依据。

Abstract: Supercritical CO₂ lipase transesterification is a new, green and efficient method, which has a good development prospect in the enrichment and enrichment of DHA, EPA and other polyunsaturated fatty acids. In this paper, the current production status of polyunsatu-rated fatty acids and the application of traditional enzyme and non-aqueous lipase method using supercritical CO₂ fluid as medium in polyunsaturated fatty acids were reviewed. By comparing the traditional separation process and combining with the latest research progress at home and abroad, to explore the advantages and application prospects of supercritical CO₂ lipase transesterification in separation and enrichment of unsaturated fatty acids, and to provide basis for related research.

1. 多不饱和脂肪酸功能、来源及其提取工艺概况

多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)，是指含有2个或2个以上不饱和双键结构且碳链长度为18-22个碳原子的脂肪酸，根据甲基末端第一个双键的位置，可以分为n-3和n-6PUFAs。n-6PUFAs如亚油酸(linoleic acid, LA)、花生四烯酸(arachidonic acid, ARA)来源丰富，通过饮食的提供足以满足身体需求，而n-3 PUFAs却无法通过饮食满足。常见的n-3 PUFAs如二十碳五烯酸(EPA, C20:5 ω-3)和二十二碳六烯酸(DHA, C22:6 ω-3)是有关人体营养与健康的重要生物活性物质，对治疗癌症 [1] 、心血管疾病 [2] 、生长发育 [3] 和风湿性关节炎 [4] 也有一定的作用。随着人们健康意识的增强，近十年对n-3PUFAs的需求在逐年增加。在欧洲，大约20%的成年人使用n-3 PUFAs补充剂 [5] ；在美国，近年来富含n-3 PUFAs的保健品一直引领着保健品市场 [6]。高品质的n-3 PUFAs的价格也水涨船高。图1展示了n-3 PUFAs产品附加值随其品质增加的价格变化情况。

Figure 1. n-3 Price changes of PUFAs products

图1. n-3 PUFAs产品价格变化情况

n-3 PUFAs通常以三种形式存在：甘油酯、乙酯和游离脂肪酸(FFA)，目前，美国食品药品管理局批准治疗各种疾病的n-3 PUFAs均以游离脂肪酸或乙酯形式生产 [7]。市场上销售的游离脂肪酸或乙酯形式的n-3 PUFAs浓缩物存在氧化稳定性低、不稳定 [8] 等问题，常见的脂肪酸乙酯(FAEE)形式的n-3 PUFAs生物利用度不高，人体中只有21%的DHA以乙酯的形式被吸收。甘油酯形式的n-3 PUFAs具有更高的氧化稳定性和生物利用度，57%的DHA以甘油三酯形式被人体吸收，吸收率可达乙酯型的300% [9]。生产更为稳定的甘油酯型n-3 PUFAs具有广泛的前景。

EPA和DHA主要存在于鱼类、藻类、植物以及转基因植物 [10] 中。鱼类是人类最先发现、最早用于富集浓缩PUFAs的原料。目前90%的DHA来源于鱼类，然而过度捕捞和市场高需求，全球鱼类资源正处于极度匮乏的状态。此外，一些鱼还含有大量的有毒重金属，如铜或汞，甚至还含有有机污染物，如多氯联苯或二恶英 [11]，这些成分对人体健康产生危害。为了海洋资源的可持续发展，也为了获取更为安全的DHA，因此需要寻找品质更佳、更为安全的n-3 PUFAs资源替代品。在海洋资源中，与鱼相比，微藻具有较高的生长率、较高的生产密度和较低的土地利用率，被认为是最有前途的n-3 PUFAs的替代来源之一，具有广泛的应用前景 [12]。利用微藻生产高质量DHA具有潜在的市场前景，也符合绿色可持续发展的绿色生产理念。

传统富集浓缩DHA的方法有尿素包合法、低温结晶法、银离子络合法等，这些方法都使用一些化学试剂、存在一定的安全隐患。由表1可知上述方法属于能源密集型，效率低，对环境、资源都有一定的不利影响。因此需要寻找一种绿色、环保、高效的富集多不饱和脂肪酸的方法。

Table 1. Comparison of advantages and disadvantages of traditional enrichment and concentration methods for DHA

表1. 传统富集浓缩DHA方法优缺点对比

2. 脂肪酶法制备多不饱和脂肪酸

传统的酯交换法富集PUFAs通常使用酸性或碱性催化剂，这可能导致选择性低和不良副反应。此外，这一过程中的高温可能会导致鱼油的氧化变质。因此需要更为温和的富集PUFAs的方法。

酶催化反应作为一种更绿色、更专一的化学催化剂替代物出现，用于加工n-3 PUFA。由于脂肪酶对底物的位置选择性，因此特别适合结构脂质的生产。脂肪酶在温和的条件下操作，可避免油脂的氧化 [13]。除此之外，脂肪酶催化效率更高，降低了生产过程中能量损耗，更适合用于大规模食品加工生产中 [14]。

传统上认为水是生物催化剂应用的唯一合适介质，但对于油脂这种非极性有机物在水中的溶解度不高，这导致在水中酶会因为动力学或热力学限制而无法进行新反应，其次在水解过程中很难控制水溶液的pH值，使脂肪酶无法处于最适pH，其稳定性和活性会受影响。在脂肪酶富集浓缩不饱和脂肪酸的过程中，水分含量大会导致其反应方向向水解方向进行，导致其甘油酯型n-3 PUFAs含量降低。为了得到含量更高的甘油酯型n-3 PUFAs，应采取其他更合适的方式。脂肪酶非水相酶解反应可以解决以上问题。

脂肪酶酯交换反应采用有机试剂，如甲醇、乙醇等，无需控制反应过程中的pH。在脂肪酶酯交换反应中，藻油或鱼油中的DHA和EPA由于位阻效应，脂肪酶无法靠近甘油酯其酯化位点，只能将单不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸等小分子酯化生成脂肪酸乙酯/甲酯，DHA和EPA留在甘油酯骨架上，达到富集浓缩PUFAs的效果，脂肪酸乙酯/甲酯可作为生物燃料。图2是脂肪酶酯交换反应化学方程式。

Figure 2. The ester exchange reaction of triglyceride and methanol produces fatty acid methyl ester (R1, R2, R3 are alkyl chains)

图2. 甘油三酯与甲醇的酯交换反应生成脂肪酸甲酯(R1、R2、R3为烷基链)

常规的脂肪酶酯交换反应虽然使用了乙醇等有机试剂可帮助油脂溶解，但藻油和鱼油的黏性大，溶解在乙醇等有机试剂的油脂含量并不多，酯交换效率会明显下降，需要添加叔丁醇等助溶剂帮助其溶解。因此脂肪酶酯交换反应会涉及多相介质 [15]，不易将产物、底物分离，因此需要一种新型、易分离介质来取代助溶剂。

3. 超临界CO₂脂肪酶非水相介质酶解富集PUFAs

3.1. 超临界CO₂脂肪酶酶解概述

以二氧化碳为溶剂的超临界流体是最有希望取代常规脂肪酶酯交换反应的绿色介质。二氧化碳是一种无毒、不易燃的“绿色”溶剂，适用于食品工业，相对于其他溶剂，它的特点是在温和条件下有一个临界点(Tc = 30℃, Pc = 7.38 MPa)。提取过程中的低温和无氧保存了生物活性化合物，使该技术适用于热敏成分，如多不饱和脂肪酸 [16]，此外使用SC-CO₂不仅可以改善了反应物的混溶性和反应介质的传质性能，而且不需要复杂的溶剂去除操作，降低了生产成本 [17]。

超临界CO₂中使用酶作为生物催化剂已在文献中得到广泛研究。自1985年Hammond等 [18] 研究者首次提出超临界流体可以作为酶催化的反应介质后，超临界CO₂中的酶催化反应备受国内外科研工作者的关注。20世纪90年代初以来，超临界流体中的酶促反应已经得到证实。超临界流体中的酶反应经常显示出比在经典条件下进行的反应速率更高 [19]。不少研究结果证实多种酶在超临界CO₂介质中可以发挥作用，且其催化活性能够保持稳定，如胰蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、淀粉酶、果胶酶等。许多酶在超临界CO₂中其构象没有发生改变。其中，脂肪酶因其在食品加工和油脂化工中的广泛应用而成为当前超临界CO₂中酶催化反应的研究热点，尤其是以脂肪酶催化的酯合成、酯交换、氧化反应等取得了较大的研究进展 [20]。

近年来，有人针对超临界二氧化碳脂肪酶酯交换反应进行了研究。Lin等人 [21] 提出在超临界CO₂介质中进行脂肪酶酯交换反应。他们在超临界CO₂介质(5小时、323 K和10.34 bar)中，通过与固定化1,3-特异性脂肪酶(Lipozyme IM-60)的酶促酯交换反应，实现鱼油的n-3 PUFAs富集。他们证实，在超临界条件下，酶促酯交换反应比在常规溶剂下高40%，可以达到从鱼油获得高质量n-3 PUFA的目的。

3.2. 超临界CO₂脂肪酶非水相酶解用于富集多不饱和脂肪酸

近年来，关于超临界CO₂脂肪酶酯交换反应富集PUFAs研究百花齐放，已经有大量实验证明超临界CO₂脂肪酶酯交换反应富集PUFAs具有广泛应用前景。首先使用超临界CO₂作为反应介质可以最大限度地减少脂质氧化，使得在超临界CO₂中获得的反应产物的酸度和总氧化值(TOTOX)较低 [22]。

Solaesa等人 [23] 通过测定精制沙丁鱼油及其混合物在SC-CO₂介质中酶酯交换反应7 h后在不同温度(40℃~90℃)下的peroxide value (PV)和anisidine value (AV)，发现PV随着反应温度的升高而降低，在此研究测定的最高温度(80℃~90℃)下获得的值约为3 meq O₂/kg，甚至低于最初的精制沙丁鱼油的PV和AV值(最初的精制沙丁鱼油的PV和AV分别为4.8 ± 0.1 meq O₂/kg和23.0 ± 0.1 O₂/kg)。其次超临界CO₂较高的扩散率(higher diffusivity)、较低的粘度(lower viscosity)和表面张力(surfacetension)是减少相间传输限制的原因，可提高酶的反应速率和酯化率 [24]。Santos等人 [25] 在SC-CO₂中使用Lipozyme 435脂肪酶对橄榄油进行酶促酯交换反应发现，在SC-CO₂中酯化率比在正己烷介质中高67%。Rathore和Madras [15] 以棕榈油、花生油等食用油和胭脂树、麻疯树等非食用油为原料，在超临界CO₂存在下用Novozym-435脂肪酶进行酶促酯交换反应。10min内转化率很高(>80%)，40 min内几乎完全转化；Ramos [26] 用白地霉脂肪酶(lipase of geotrichum candidum)以油酸(OA)与甲醇(MeOH)为底物在超临界介质(SC-CO₂)反应，当油酸：甲醇摩尔比为1:3、酶活2.5 U/g、温度30℃、压力30 MPa、反应时间1h时，反应产率提高了3倍，达到37.73%。因此超临界CO₂脂肪酶酶解富集PUFAs具有广泛的前景。

3.3. 超临界CO₂脂肪酶非水相酶解应用的前景及挑战

不同于常压下脂肪酶非水相酯交换反应，超临界CO₂脂肪酶非水相酶解环境还面临着压力、反应温度、超临界CO₂的低水分含量等因素对脂肪酶非水相酶解反应效率、脂肪酶残余活性及脂肪酶酶结构的影响，因此在后续的研究中着重探究超临界CO₂条件下产物的得率及效率、脂肪酶残余酶活及结构变化和产物的理化性质。

4. 前景展望

随着人们对环境友好型绿色富集浓缩多不饱和脂肪酸方法的日益关注，超临界CO₂非水相酯交换反应法作为一项绿色、环保、高效的富集浓缩多不饱和脂肪酸技术，因其对环境友好、产物易分离等特点受到越来越多科研工作者的青睐。但脂肪酶在超临界CO₂中最适条件与常规环境不同，需要探究其富集浓缩多不饱和脂肪酸最适条件及在超临界CO₂中的脂肪酶活性及结构变化，以得到最佳富集效果。