间充质干细胞治疗克罗恩病肛周瘘管的研究进展

Study Advances in the Treatment of Perianal Fistulizing Crohn’s Disease with Mesenchymal Stem Cells

摘要: 克罗恩病(Crohn’s disease, CD)是一种肠道慢性进展性炎性疾病，病变以末段回肠及其邻近结肠为主，可累及从口腔至肛周的任一部位，肛周瘘管是克罗恩病的常见并发症，严重影响患者的生活质量。间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)具有免疫调节和抗炎作用，在治疗克罗恩病肛周瘘管方面具有发展潜力。本文将对近年来MSCs用于克罗恩病肛周瘘管的治疗情况进行综述。

Abstract: Crohn’s disease (CD) is a chronic and progressive inflammatory disease of the intestinal tract. The pathological changes of CD are mainly in the terminal ileum and its adjacent colon, and can affect any part from oral cavity to perianal region. Perianal fistula is a common complication of CD, which seriously affects the quality of life of patients. Mesenchymal stem cell (MSC) has immunomodulatory and anti-inflammatory effects and has a good effect in the treatment of Crohn’s disease anal fistula. This article will review the application of MSCs in the treatment of perianal fistula in Crohn’s disease in recent years.

1. 引言

克罗恩病(Crohn’s disease, CD)是一种可累及全消化道的肠道慢性炎性疾病，病变以末段回肠及其邻近结肠为主。CD在西方国家发病率较高，为8.9/10万~17.7/10万，我国的CD发病率约为0.34/10万 [1] [2] ，虽然发病率较西方国家低，但随着城市工业化和人口密度的增加，CD的发病率也显示出逐年上升的趋势 [2] 。克罗恩病的常见症状是腹泻、腹痛、体重减轻，可伴有皮肤、黏膜、关节和器官受累等肠外病变，以及发热、食欲不振、贫血等全身症状，还可伴有肛周病变(如肛周瘘管、肛周脓肿、皮赘、肛裂、溃疡等)、瘘管形成、腹腔脓肿、肠腔狭窄和肠梗阻、消化道出血、穿孔等并发症，其中以肛周病变为首发症状者并不少见，报道指出约43.7%~72.4%的肛周克罗恩病(perianal Crohn’s disease, PCD)患者在CD确诊前出现肛周病变 [3] ，其中肛周瘘管是最常见的肛周病变类型，约达69.8% [4] ，病情严重的CD肛瘘患者会出现肛周疼痛、肛周瘘管脓性分泌物渗出、大便失禁等症状，严重影响患者生活质量 [5] [6] [7] [8] 。

肛周瘘管是克罗恩病(CD)的常见并发症。流行病学研究表明，诊断CD后的20年后肛周瘘管的累计发病风险为23%~28.3%，在一项关于儿童CD的队列研究报道5年内儿童CD肛周瘘的累积发生率为5.0%，10年内为9.4% [9] [10] [11] [12] 。CD肛瘘的发生机制尚未完全明确，根据目前的研究结果，CD肛瘘的发生可能与上皮–间质转化、基质重塑酶、遗传易感性、炎症因子、肠道微生物环境、瘘道上皮化和肛管腔内高压力等因素相关 [13] [14] 。美国胃肠病学协会将瘘管分为单纯性瘘管和复杂性瘘管，单纯性瘘管是指只有一个外部开口的低位瘘管，包括表面瘘管、低位括约肌间或低位跨括约肌瘘管，不伴有疼痛或肛周脓肿、直肠阴道瘘及肛门直肠狭窄；复杂性瘘管包括括约肌外瘘、括约肌上瘘、括约肌间高位瘘或经括约肌高位瘘，或有多个外开口，或伴有脓肿、直肠阴道瘘或肛管直肠狭窄 [15] [16] 。研究结果表明：单纯瘘管比复杂瘘管更容易愈合，且复发较少，而在复杂的肛周瘘管患者中，仅1/3的患者在常规治疗后获得持久的缓解，因此肛瘘的治疗极具挑战性 [17] 。

2. 肛周瘘管的常规治疗方法

现有的关于CD肛周瘘管的临床治疗方法包括抗菌药物(常用的有甲硝唑、环丙沙星)、糖皮质激素、免疫调节剂(如硫唑嘌呤、巯基嘌呤、环孢素、甲氨蝶呤等)、抗肿瘤坏死因子药物(如英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)和赛妥珠单抗(certolizumab)等)、手术治疗(脓肿引流和挂线疗法、瘘管切开、纤维蛋白胶、生物假肢插头、粘膜瓣推移术、括约肌间瘘管结扎术、粪便改道、直肠切除术等) [18] 。一项研究表明，经过药物治疗和/或手术治疗后，单纯瘘管比复杂瘘管更容易出现持久缓解(66.7% vs 37%)，然而大约有37.7%的CD肛瘘患者出现复发，而与复杂瘘管相比，单纯瘘管的复发率较低(26.7%比41.9%)，因此对于CD肛瘘的常规策略的治疗效果并不令人满意，尤其是复杂肛瘘 [17] 。

3. 间充质干细胞

近年来，干细胞疗法成为治疗克罗恩病的一种有前途的方法，MSCs免疫原性较弱，因此可以跨越人类白细胞抗原屏障使用，其具有免疫抑制、抗炎、修复损伤组织等作用，在CD肛周瘘管的治疗中显示出可喜的效果。

3.1. MSCs的来源

MSCs的概念最先被Caplan等提出，它可以在体外以贴壁细胞的形式增殖，具有成纤维细胞样的形态，在体外形成集落，并可以分化为成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞 [19] [20] 。MSCs来源广泛，目前的研究表明，可以从骨髓、脂肪组织、脐带、胎盘、子宫内膜息肉、月经血或大多数器官的结缔组织中(肾、肝、肺和牙科组织)分离 [21] [22] [23] [24] 。根据目前的研究，治疗CD肛瘘的细胞来源大多是骨髓组织、脂肪组织，仅有1项研究的细胞来源是脐带，可能是由于脐带间充质干细胞(UC-MSCs)的获取相较于骨髓以及脂肪组织来源的MSCs而言，在临床上更不易获得 [25] - [32] 。此外，采用异体干细胞的研究略多于自体干细胞，这可能是由于自体骨髓间充质干细胞不能根据要求立即获得，因为分离和扩增到足够数量的骨髓间充质干细胞需要数周时间，这会导致治疗延迟 [30] 。对于不同来源的MSCs治疗CD的疗效和安全性的差异，仍需更多的大样本的临床研究加以证实。

3.2. MSCs治疗CD的作用机制

目前关于MSCs治疗CD肛瘘的确切机制尚不清楚，已知的MSCs治疗CD肛瘘相关的机制涉及以下几个方面：1) 免疫调节功能：MSCs在炎症细胞因子的刺激下可以表达吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)或诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，可以抑制T细胞分裂增殖，阻断T细胞周期，使T细胞停留在G0/G1期 [33] ；MSCs可以诱导Th2的分化与成熟，进而促进Th1细胞的凋亡，减轻肠道黏膜炎症 [34] 。MSCs抑制单核细胞产生树突状细胞，抑制幼稚和记忆性的CD4+细胞，通过下调成熟树突状细胞上的共刺激分子来阻止T细胞的激活，促进调节性T细胞(Treg)的产生 [35] 。MSCs可以通过抑制T细胞分泌干扰素(IFN)-γ来抑制B细胞增殖和浆细胞分化，也可以通过下调树突状细胞(DC)分泌的BAFF (B-cell activating factor)来抑制B细胞，还可以通过促进CD23+CD43+调节性B细胞(Breg)的增殖和CD23−CD43− B细胞的转化来增加CD23+CD43+ Breg细胞，进一步增加抗炎因子白细胞介素-10 (IL-10)的产生，从而抑制炎症因子的分泌和T细胞的增殖，减轻肠道炎症 [36] [37] 。MSCs可以直接与激活的巨噬细胞相互作用，下调Th1细胞增殖，激活Treg，并增加IL-10的产生 [38] 。2) 抗炎功能：MSCs的抗炎特性主要与细胞因子有关。MSCs可以降低创面组织中IL-1、IL-6、IL-8、IL-17、IFN-γ和肿瘤坏死因子(TNF)-α等促炎因子的水平，并能上调抗炎因子IL-3、IL-4、IL-5、IL-10等的表达，通过改变免疫细胞的细胞因子谱，调控免疫细胞的增殖活化，从而减轻创面炎性反应 [39] 。MSCs还可以在促炎因子如TNF-α、干扰素IFN-γ的刺激下分泌免疫调节因子，如前列腺素E2 (PGE2)和肿瘤坏死因子α刺激基因-6，诱导促炎性的M1型巨噬细胞转化为抗炎性的M2型巨噬细胞 [40] 。3) 组织修复功能：MSCs具有归巢特性，在趋化因子(如基质衍生因子-1 (SDF-1)/CXC趋化因子受体4 (CXCR4)轴)、细胞因子(如：骨桥蛋白，OPN)、生长因子(如：血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子-1 (IGF1)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子β1 (TGF-β1)等)以及机械因素的作用下可以迁移到损伤部位，定向分化成损伤部位的局部成分，以及分泌旁分泌因子(如：TGF-β、VEGF-1、IGF1等)促进组织修复或再生，改善创面 [41] 。4) 改善肠道菌群：肠道菌群的变化在CD的发病中起着重要作用，与CD肛瘘的发生也相关。一项动物实验 [42] 表明MSCs可以使结肠炎小鼠模型肠道内的拟杆菌门、非杆菌门和T菌门表达上调，变形杆菌门表达下调，恢复了α多样性，并逆转了肠道微生物区系丰度的变化，提示MSCs治疗CD的机制可能与肠道微生物区系有关，但由于小鼠模型无法完全模拟人类CD，因此还需进一步的临床研究确定MSCs治疗是否使CD患者的肠道微生物区系正常，但这为MSCs治疗CD肛瘘的机制研究提供了一个新的方向。

3.3. MSCs治疗CD的方式

目前临床研究常用的MSCs治疗CD方式主要为局部注射和静脉输注。在MSCs治疗CD的临床研究中，主要使用静脉输注MSCs，其操作简便。静脉输注MSCs后可能出现一些不良反应，如：输注后出现阑尾炎及艰难梭菌结肠炎 [43] 、短暂轻微的过敏反应 [44] 、轻度上呼吸道感染 [45] 、轻度头痛、恶心 [46] 等，虽然有报道输注后发现乙状结肠腺癌，但由于其输注前即存在黏膜异型增生，所以MSCs输注与肿瘤之间的关联并不好区分，除此之外未见其他严重不良反应，耐受性较好。MSCs治疗CD肛瘘的临床研究主要应用局部注射的方法，将MSCs注射在瘘管内口和/或瘘管壁周围。在一项系统评价，静脉注射MSCs治疗管腔性炎症性肠病(包括CD)的有效率高达40.5% (95% CI, 7.5%~78.5%)，而当MSCs局部注射到病变的CD瘘管时，有效率为61.3% (95% CI, 35.6%~84.6%)，静脉注射MSCs的疗效低的原因尚不清楚，有结肠炎动物模型研究表明，静脉注射的MSCs只有一小部分(1%~5%)到达炎症的结肠，剩余的间充质干细胞由肺部过滤(首过效应) [47] 。另外还有将MSCs包裹于可吸收的生物基质上作为瘘管塞放置于瘘管处 [48] ，或将MSCs与纤维蛋白胶混合注射于瘘管内口周围黏膜及瘘管壁 [49] ，已有研究证实其安全性和可行性，不过该研究样本量小，需要进一步的大样本的临床研究支持 [40] 。目前有通过肠系膜上动脉注射MSCs治疗溃疡性结肠炎的报道，输注后无明显不良反应 [50] ，但由于其为有创性操作，容易增加感染及并发症风险，不利于临床应用。有一项研究报道了经肠系膜动脉输注MSCs治疗CD，尚未有报道其有不良反应发生。

3.4. MSCs治疗CD的剂量

目前，对于间充质干细胞治疗CD的剂量尚无统一的标准。Ilse Molendijk等 [25] 对21名难治性克罗恩病肛瘘患者进行局部注射同种异体骨髓间充质干细胞的双盲安慰剂对照试验，将MSCs分为1 × 10⁷、3 × 10⁷、9 × 10⁷三个组与安慰剂(无细胞溶液)进行对照，结果表明异体骨髓来源的骨髓间充质干细胞在难治性肛周瘘管患者中的局部应用是安全可行的。与安慰剂相比，3 × 10⁷ MSCs的局部治疗显示出更好的瘘管愈合。Jian Zhang等 [26] 对82例确诊为CD并接受类固醇维持治疗超过6个月的患者进行随机对照研究，随机选择41名共接受4次外周静脉输注1 × 10⁶个UC-MSCs/kg，每周1次，随访12个月，结果表明在接受稳定类固醇剂量的CD患者中，UC-MSCs疗法可以显著且安全地改善疾病状况。一项单中心的回顾性研究 [31] 对12名克罗恩病肛周瘘管患者予以局部注射MSC治疗，66.7%的患者获得了长期愈合，为MSCs治疗CD的有效性和安全性提供了数据。但Jian Zhang等 [26] 、Schwandner O等 [31] 对于MSCs的试验并未对细胞剂量进行研究，无法确定剂量多少对于CD瘘管的效果高低，而Ilse Molendijk等 [25] 进行了3个梯度的细胞剂量的研究，初步证明3 × 10⁷ MSCs剂量的瘘管愈合率更高，但此次研究涉及样本量较小，尚缺乏多中心大样本验证。

3.5. MSCs治疗CD的有效性和安全性

对克罗恩病患者肛周瘘管局部注射间充质干细胞的有效性首先在开放标签研究中被测试，该研究使用来自脂肪或骨髓来源的自体细胞，在所有研究中都观察到了高的瘘管闭合率(75%~77%) [28] [51] [52] 。一项安慰剂对照试验 [25] 纳入了21名克罗恩病肛周瘘管患者，以MSCs剂量递增的方式研究了MSCs的有效性，获得了28.6%~85.7%的瘘管愈合率，相对于安慰剂组33.3%而言，疗效可观，且所有患者对局部注射间充质干细胞耐受性良好，术中或手术后均未出现输液反应，其中1例患者术后6小时出现发烧(39.7℃)，但考虑术前肛管狭窄扩张有关。一项大样本的随机安慰剂对照试验比较了单次注射1.2 × 10⁸同种异体脂肪来源的间充质干细胞或安慰剂的疗效，分别在107名和105名患者中进行了比较 [32] 。该项研究中，将主要终点定义为第24周的综合缓解，即在基线时引流的所有外部开口经治疗后闭合，以及通过MRI证实在至少两个三维空间中没有大于2 cm瘘管。结果表明克罗恩病伴复杂肛周瘘管且对常规或生物治疗无反应的患者中，单独注射Cx601或在现有药物治疗基础上加用Cx 601治疗的患者中，50%在第24周获得了联合缓解，而安慰剂组为34%，并且该治疗的有效性可持续至注射治疗后52周，甚至超过半数的患者持续缓解至治疗后156周，耐受性良好 [53] [54] 。一项有24名患者参加的开放式临床试验显示56.3%的患者治疗后瘘管完全闭合，30%的患者现有瘘道完全闭合 [29] 。江滨等 [27] 的研究显示总瘘管愈合率60.57%，其中克罗恩病瘘管愈合率为90.91%，表明自体脂肪干细胞移植是治疗复杂性肛瘘特别是克罗恩病肛瘘的一种有效方法，实验中出现的不良事件均可用其他原因解释，且无需处理，无严重不良事件发生。大多数研究都是将MSCs通过静脉或直接注入瘘管中，均获得了良好的疗效，在一项I期研究中，将自体骨髓间充质干细胞附着到生物可吸收基质上，进而将瘘管塞放置于瘘管处，结果显示12例患者中9例在3个月时完全闭合，10例(83.3%)在6个月时完全闭合，在试验中没有发生与输注MSCs相关的不良反应事件 [48] 。尽管研究数量小，但也为MSCs治疗CD肛瘘的有效性提供了数据，同时也提供了一种新的输送MSC的方法。另有一项为期4年的研究 [30] 显示，在3 × 10⁷的队列中，所有的瘘管在bmMSCs治疗4年后全部闭合，队列1 × 10⁷和队列9 × 10⁷的瘘管闭合率分别为63%和43%，也初步表明bmMSCs治疗长期来看也是安全有效的，不过需要更多大样本的研究进一步证实该观点。

动物研究表明在肿瘤微环境的诱导下，MSCs 通过TGFβ1-Smad2信号通路可以分化为肌成纤维细胞，并通过促进肿瘤间质微环境重塑，进一步加速肿瘤的发展 [55] 。有研究报道静脉输注MSCs治疗腔内CD后发现乙状结肠腺癌，该患者进入研究前便存在黏膜异型增生及建议手术治疗的病史，但研究者并未注意这一点，研究完成后发现乙状结肠腺癌，关于MSCs与肿瘤的关联尚不明确，但不完全排除MSCs使异型增生进展为肿瘤的可能 [46] 。4年的随访研究报道了一例与MSCs注射无关的B细胞淋巴组织增生性疾病 [30] ，另有MSCs治疗CD肛瘘的研究随访至156周，报道一例与MSCs无关的良性纤维腺瘤，并未发现与治疗相关的致瘤性或异位组织形成相关的安全性问题 [54] ，一项病例系列研究报告了一例患者局部注射MSCs后16周发生睾丸癌，考虑与MSCs注射的关系不大，但不排除局部免疫抑制促进肿瘤进展的可能性 [55] ，有研究报告了一例子宫肌瘤，但综合多方面因素后，不认为与MSCs致瘤性相关 [29] 。其他关于MSCs治疗CD的临床研究尚未有相关报道，仍需进一步研究。

对于接受MSCs治疗的患者，获得瘘管闭合的比例28%~90%不等，不同的剂量、注射方式可能会影响瘘管的愈合率，从两项研究结果综合来看，3 × 10⁷的治疗剂量似乎瘘管愈合率更高，并且疗效能持续4年 [25] [30] ，但一项关于MSCs治疗CD肛瘘的meta分析提示高剂量治疗组不具有提高疗效的趋势 [57] ，但该研究纳入文献的数量小，仅纳入了5篇文献，其中有剂量对比研究的文献只有2篇，且涉及的样本量较小，结论尚需更多大样本随机对照研究进行验证。

4. 讨论

综上，间充质干细胞作为新兴的治疗方法，在治疗克罗恩病肛周瘘管方面有其独特的优势，已有研究证实应用MSCs是安全可靠的 [25] [27] [30] [32] [48] [53] [54] ，甚至有可能作为抗菌药物、免疫抑制剂或生物制剂治疗失败的补救治疗措施。MSCs的短期治疗效果已经得到了证实，而Garcia-Olmo D.等 [58] 、Barnhoorn M. C.等 [30] 、Panés J.等 [54] 的研究证实MSCs治疗CD肛瘘的疗效可以长期维持至治疗后52周、104周甚至4年，虽然样本量小，但为临床治疗方法的选择提供了方向，也为进一步的循证学研究提供了支持。但目前仍存在一些问题需进一步研究：1) 关于治疗CD肛瘘的MSCs最理想的来源尚未有定论，Cheng F.等 [59] 的meta分析表明自体骨髓间充质干细胞的疗效优于异体骨髓间充质干细胞，并且不存在伦理冲突，但由于自体骨髓MSCs不能及时获得，同时需考虑患者的一般情况，因此相对而言，异体骨髓MSCs更容易获得；此外，该研究表明，脂肪来源与骨髓来源的MSCs的疗效并没有统计学差异，但一项研究 [60] 表明，脂肪组织来源的间充质干细胞在体外抑制免疫反应方面可能优于骨髓间充质干细胞，结合脂肪来源的MSCs容易获得且来源丰富，因此，脂肪组织来源的MSCs可能是未来的优先选择，但该研究目前仍缺乏不同来源MSCs治疗CD疗效的对比研究；2) 理想MSCs的治疗剂量尚不明确，Ilse Molendijk等 [25] 和Barnhoorn M. C.等 [30] 的研究提示相比1 × 10⁷和9 × 10⁷的治疗剂量来说，3 × 10⁷的细胞数量，瘘管愈合率更高，但Cheng, F.等 [59] 则认为与瘘管大小成比例的细胞数量可以提高疗效，因为细胞可以均匀地注射到瘘管中，而较高的细胞浓度可能导致较低的存活率和/或细胞功能，并且较大量的细胞可能会表现出免疫原性，进而导致细胞的清除或失活增加，这为将来关于MSCs的给药方式的研究提供了指导。但由于研究数量有限，不能提供最佳剂量的建议，还需要更多大样本的随机对照研究提供循证医学支持；3) 由于MSCs的免疫抑制性，治疗过程中是否致癌尚不明确。有动物研究 [61] [62] [63] 表明间充质干细胞可以促进肿瘤生长，但在已发表的研究中尚未有相关报道，考虑到MSCs的特殊性，未来仍需更大样本的长期随访研究评估其安全性以及是否致癌；4) MSCs能否联合其他药物以提高瘘管愈合率，Belyakov N.等 [64] 、Knyazev O. V.等 [65] 的研究表明，MSCs联合抗肿瘤坏死因子药物有助于降低单纯瘘管的复发，延长瘘管闭合时间，但样本量尚小，未来仍需更多大样本随机对照实验对MSCs联合抗肿瘤坏死因子甚至免疫抑制剂进行研究，以为临床决策提供证据。

NOTES

^*通讯作者。