缺氧骨髓微环境与急性髓系白血病的相关研究

Study of Hypoxic Bone Marrow Microenvironment Associated with Acute Myeloid Leukemia

摘要: 急性白血病中最常见的类型是急性髓系白血病，约占成人病例的80%，且生存率很低。急性髓系白血病是一种侵袭性的血液系统恶性肿瘤，而缺氧是肿瘤的常见现象。近年来，众多研究发现缺氧骨髓微环境在急性髓系白血病发病机制中发挥重要作用。因此，有必要对缺氧骨髓微环境与急性髓系白血病的能量代谢、血管生成、调控细胞增殖、促进细胞归巢、耐药等方面的关系进行阐述。

Abstract: The most common type of acute leukemia is acute myeloid leukemia, which accounts for approxi-mately 80% of adult cases and has a poor survival rate. Acute myeloid leukemia is a highly hetero-geneous hematologic neoplasm. Hypoxia is a common phenomenon in neoplasms. In recent years, numerous studies have found that the hypoxic bone marrow microenvironment plays an important role in the pathogenesis of acute myeloid leukemia. Therefore, it is necessary to elaborate the rela-tionship between the hypoxic bone marrow microenvironment and acute myeloid leukemia in terms of energy metabolism, angiogenesis, regulation of cell proliferation, promotion of cell homing, and drug resistance.

1. 引言

急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia, AML)是侵袭性的血液系统恶性肿瘤，其特征是造血干/祖细胞分化潜力受阻，伴随细胞遗传学畸变，复杂性体细胞突变和基因表达改变 [1] 。其死亡率高，预后较差，对人类健康构成了巨大的威胁。近年来，众多研究涉及缺氧微环境在促进血管生成，加速细胞侵袭、转移，支持细胞耐药中的重要作用及缺氧靶向治疗的新进展。缺氧是实体肿瘤微环境中的一种常见情况，在能量代谢、血管生成和转移等各种生物过程中发挥重要作用 [2] [3] 。然而，缺氧在AML中的病理生理学作用仍有争议。在骨髓(Bone marrow, BM)中，低氧分压(pO₂)是生理性的，与正常BM相比，白血病BM中缺氧微环境被扩展，并伴有白血病干细胞(Leukemia stem cells, LSC)的增殖 [4] 。缺氧的BM微环境也被证明有助于急性白血病的进展，耐药性和微小残留病(MRD)的发生 [5] [6] [7] 。为了应对缺氧，细胞会改变其缺氧相关基因表达，这已被证明与各种实体瘤的预后相关。

2. 骨髓缺氧微环境

AML的发生、发展不仅依赖于细胞固有致癌基因的改变，也与骨髓微环境(BMM)密切相关。BMM包括各种造血、非造血细胞，细胞外基质以及分泌的各种细胞因子，共同参与血细胞的生成，支持组织器官造血 [8] [9] 。低氧是BMM和造血干细胞(HSC)生态位的重要组成部分，骨髓的低氧微环境，称为低氧生态位，可支持HSC的静止并维持长期的增殖活动，缺氧还影响造血祖细胞(HPC)的扩增并增强红细胞生成和巨核细胞生成 [10] 。然而，在AML中，一旦受到AML细胞信号的刺激，小动脉的内皮细胞(EC)和周围的间充质干细胞(MSC)就会发生变化。然后小动脉的通透性增加，随后BM中的氧梯度消失，导致整个BM生态位和HSC循环极度缺氧，导致BMM紊乱和重塑，从而将正常的HSC微环境转变为异常的LSC微环境。MSC是骨髓造血微环境的重要组分，在LSC微环境中，MSC产生炎症细胞因子IL-6，可能对免疫细胞和免疫抑制产生相反的作用。TNF-α是血液系统恶性肿瘤发生的关键介质，白血病发生时MSC产生TNF-α增多，可能有助于肿瘤生长和免疫抑制。MSC还产生IL-10，这是一种抗炎细胞因子，被认为是AML患者的不良预后因素 [11] 。此外，MSC还可以分泌生长因子，如GM-CSF和G-SCF，直接参与耐药性。微环境中的MSC、多种免疫和非免疫细胞及其分泌的各种因子，能够发挥驱动慢性炎症、免疫抑制和促血管生成等作用。AML细胞能够在这样的环境中适应和生长，而被宿主免疫监视系统发现和根除的可能性大大降低，从而支持AML的发生、发展及耐药 [12] [13] 。

3. 缺氧诱导因子(HIF)

缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor, HIF)，在正常组织细胞对缺氧的急性反应中起重要作用，而在肿瘤细胞中，HIF诱导能量代谢的变化，并阻止缺氧诱导的细胞坏死。迄今已发现的HIF包括HIF-1、HIF-2、HIF-3，HIF目前关于HIF-1的研究较多，它是一种异二聚体bHLH-PAS复合物，主要由HIF-1α和HIF-1β两个亚基构成。在常氧状态下，HIF-1α亚单位被脯氨酰羟化酶(PHD)羟基化。然后羟基化的亚基与VHL肿瘤抑制蛋白(pVHL)结合形成复合物，被E3连接酶识别，并通过蛋白酶体途径诱导HIF的降解 [14] 。此外，抑制HIF的因子(FIH)通过羟化作用抑制HIF的转录活性。在缺氧条件下，PHD和FIH的下调会诱发HIF-1α的稳定并促使其转位到细胞核，在那里HIF-1α与HIF-β相连接。在细胞核中HIF-α/β复合物与缺氧反应元件(HRE)结合，调节一些基因的转录。HIF-1α诱导许多与癌细胞生长和生存、血管生成、转移、癌症代谢、癌症干细胞维持和对各种癌症治疗方式的抵抗有关的基因表达 [15] 。血管内皮生长因子(VEGF)；内分泌腺源性VEGF (EGVEGF)，胰岛素样生长因子-2 (IGF2)，P53和P21；转化生长因子-β (TGF-β)；葡萄糖转运体1,3 (GLUT1,3；乳酸脱氢酶-A (LDHA)；基质金属蛋白酶(MMPs)和一氧化氮合成酶(NOS₂)等是癌症期间HIF-1α上调的基因。而且这些基因的表达产物几乎均可以保护细胞抵抗缺氧所致的损伤，促进肿瘤细胞恶性转化 [16] 。

4. 缺氧BMM在AML发病机制中的作用

缺氧BMM可通过HIF-1α在AML发病机制中发挥作用。HIF-1α下游基因众多，而这些下游基因的表达与能量代谢，血管生成，细胞存活和增殖，细胞归巢和迁移，化疗和放射抗性、遗传不稳定性、免疫逃避、和干细胞维护等细胞功能有关 [17] 。

4.1. 调节能量代谢

20世纪90年代，Otto Warburg首次观察到肿瘤比周围正常组织消耗更多的葡萄糖，从而提出了有氧糖酵解现象，这种现象现在被称为Warburg效应。有氧糖解的发生可归因于增殖细胞(如肿瘤细胞)对ATP的代谢需求增加 [18] 。葡萄糖可以在糖酵解途径中随着乳酸的产生而消耗，或者通过线粒体中的三羧酸循环(TCA)和氧化磷酸化(OXPHOS)将丙酮酸转化为二氧化碳和氧气 [19] 。丙酮酸激酶(PK)作为一种糖酵解途径的酶，催化糖酵解的最终步骤，即从磷酸烯醇丙酮酸(PEP)生成丙酮酸，然后从细胞质转移到线粒体中，在线粒体中发生氧化呼吸。一般来说，在缺氧条件下，癌细胞的代谢从OXPHOS变为糖酵解代谢。低氧影响许多代谢途径，包括糖酵解、三羧酸循环和磷酸戊糖途径，以创造一个酸性环境，并减少活性氧(ROS)，从而促进癌细胞增殖 [16] 。

4.2. 促进血管生成

缺氧和血管形成是许多血液系统恶性肿瘤的两个常见特征。恶性造血细胞高度消耗氧气，分泌促血管生成分子，如血管内皮生长因子A(VEGFA)22和白细胞介素，并通过BM-MSC137诱导胎盘生长因子(PlGF)分泌。新生血管不仅提供了更多的营养和氧气，而且也会促进恶性细胞的生存、增殖和耐药性。例如，恶性造血细胞产生的VEGFA刺激血管生成，但也以自分泌的方式向恶性细胞发出信号，以促进其自身的生存和增殖 [1] 。

有研究发现，缺氧和HIF-1α、HIF-2α在肿瘤血管生成过程中发挥重要作用 [20] 。HIF-1α作为VEGF的上游靶基因，当进入细胞核后，可以与靶基因VEGF DNA结合，启动VEGF mRNA的转录。组织缺氧时，HIF-1α促进VEGF转录，同时能增加VEGF mRNA的稳定性，从而上调VEGF表达，VEGF能特异性促进血管内皮细胞分裂增殖，具有较强的血管通透性，且与细胞外基质相联系，促进肿瘤血管的生成和浸润 [21] 。此外，HIF-1α还能刺激一种叫做HuR的RNA结合蛋白高表达，该蛋白可与VEGF mRNA的3’非转录区结合，减少VEGF的降解，从而提高VEGF水平。因此，HIF-1α通过影响VEGF的表达可能会增加AML白血病细胞的增殖和侵袭性 [22] 。同时，VEGF信号不仅刺激血管生成，而且还诱导细胞因子，如粒细胞–巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞–集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞–集落刺激因子(G-CSF)、IL-6和不同类型细胞产生的干细胞因子(SCF)的分泌，从而促进恶性造血细胞增殖。

4.3. 调控细胞增殖、凋亡

在缺氧条件下，由于线粒体损伤，细胞无法为蛋白质合成和其他重要生物过程提供足够的能量，因而导致细胞周期停滞和凋亡。许多研究表明，HIF-1α在缺氧诱导的细胞凋亡过程中具有关键功能 [23] 。p53作为一种肿瘤抑制蛋白可以直接与HIF-1α亚基相互作用，因此这种相互作用在缺氧条件下稳定并激活p53。这些数据表明，HIF-1α的表达可能导致缺氧细胞内p53蛋白的积累，从而通过p53刺激导致细胞凋亡。

HIF-1α表达促进多种生长因子的生成(如TGF-α，IGF2、FGF等)，与HIF-1α下游受体结合，通过 PI3K/Akt/mTOR、JAK/STAT信号通路促进细胞增殖。HIF-1α表达水平上调后，HIF-lα与EPO的低氧结合区域结合，激活EPO表达，使红细胞生成增加，调控红系干/祖细胞分化，也促进血液向组织转运O₂ [24] 。此外，HIF-1α通过自分泌活动因子(autocrine motility factor, AMF)，调控红系干/祖细胞的迁移。HIF-1α通过自分泌信号转导途径促进自身生成，促进AML肿瘤细胞发生发展。

正常的HSC维持细胞内缺氧并稳定HIF-1α蛋白。在HIF-1α缺陷小鼠中，HSC以p16(Ink4a)/p19(Arf)依赖的方式失去了细胞周期的静止性，并且在包括骨髓移植，骨髓抑制或衰老在内的各种应激条件下，HSC数量均下降 [25] 。Wang等研究发现HIF-1α通过阻断Hesl基因与启动子N-box结合，阻断Hesl基因自我调节，使Notch信号通路中的Hesl表达持续上调，维持LSC的自我更新。此外，在AML移植小鼠模型中，沉默HIF-1α和使用HIF-lα抑制剂棘霉素(echinomyci)，可诱导LSC凋亡，使移植小鼠LSC生长能力受损 [26] 。最新研究发现，HIF-lα靶基因同样在TP53突变型和野生型AML细胞中富集，棘霉素与靶基因的启动子区域结合，抑制HIF-1α活性，杀伤TP53突变的HSC，并直接杀伤AML LSC亚群 [27] 。对新诊断AML患者及健康个体外周血提取的总RNA进行实时荧光定量PCR分析的研究结果显示，外周血HIF-1α水平可作为AML髓外浸润和疾病进展的早期指标物 [28] 。因此，抑制HIF-1α及其下游因子表达可能成为AML患者的新治疗方法。

4.4. 加速细胞的迁移和归巢

在AML的临床诊断中，经常检测到骨髓间充质干细胞(MSCs)的减少或丢失，这种“丢失”现象实际上是由于MSCs转化为CA-MSCs后表型发生了变化。因此，MSCs被认为是一种重要的肿瘤基质调节因素，具有促肿瘤和抗肿瘤作用 [29] 。有研究证明MSCs在正常条件下分泌CXCL6，以维持动脉生态位的稳定性。然而，在缺氧BMM中，AML细胞促进MSCs分泌大量炎症因子CXCL2。CXCL2扮演着“沟通者”的角色，将AML细胞和骨髓间充质干细胞“联合”在BMM中，创造出有利于AML细胞的生长微环境，使其更好地生存和增殖。CXCL2促进AML细胞和MSCs的迁移，这证明了这一点。先前的研究表明，CXCR4在所有AML细胞中都作为内部分子表达，在某些特定的AML细胞中作为表面分子表达，而在缺氧条件下其表达水平上调。体外细胞培养和异种移植模型证实了CXCL12/CXCR4轴在AML细胞归巢中的基本作用 [30] 。同样，CXCL2/CXCR2也促进AML细胞的迁移和归巢，并且CXCR2的表达在缺氧条件下上调。CXCL2通过与受体CXCR2结合发挥作用。相关研究表明，阻断CXCR2的作用会削弱体内AML细胞的生长，CXCR2表达水平较高与临床预后不佳有关 [31] 。此外，有研究发现CXCL2在难治性AML患者中的表达显著增加，且总体生存时间较短 [12] 。

4.5. 支持耐药

药物代谢受到缺氧下药物代谢酶和转运蛋白的药代动力学、表达和功能变化的显著影响。缺氧通过HIF-1α影响细胞色素P450 (CYP450)的转录和功能 [32] 。CYP450参与抗肿瘤介导的AML细胞对化疗的耐药性 [33] 。药物分解代谢过程途径，如“外源性代谢过程”、“药物分解代谢过程”、“其他药物代谢酶”、“细胞色素P450药物代谢”和“细胞色素P450对外源性药物的代谢”显著富集，这可能与AML缺氧微环境中化疗药物浓度和敏感性变化有关。缺氧可能会促进血管生成，扰乱细胞介导的免疫平衡，并影响药代动力学，导致不良预后。缺氧还可以通过激活磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/哺乳动物雷帕霉素靶点(mTOR)途径并与PIM表达协同作用，为AML细胞提供生存优势 [34] 。AML细胞中PIM和PI3K协同激活mTORC1/S6K/4EBP1途径促进自身增殖、防止线粒体介导的细胞凋亡。mTOR是线粒体最重要的功能调节器之一，mTOR的抑制可以减少线粒体损伤，并有益于HSC的生存 [35] 。mTOR通路在缺氧条件下维持AML细胞处于G0/G1期，这表明缺氧有助于AML细胞的化疗耐药性 [36] 。

5. 结语

AML作为一种多发的恶性血液系统肿瘤，严重影响了人类的健康。证据表明，缺氧是癌症进展的首要驱动因素和主要调节因素。因此，靶向缺氧是预防癌症发展的最重要途径之一。缺氧BMM、HIF-1α通过调节能量代谢、促进血管生成、调控细胞增殖/凋亡、加速细胞归巢以及支持耐药性等方面促进AML的发生、发展。由于缺氧在癌症发展的不同阶段具有复杂甚至相反的功能，所以需要进一步研究缺氧BMM、HIF-lα对LSC及HSC的作用机制，以寻找新的AML靶向治疗方法的方法。

NOTES

^*通讯作者。