1. 引言
1908年Leo Buerger首次描述了该疾病。血栓闭塞性脉管炎(TAO)的发生率在世界范围内分布广泛，但分布非常不均 [1] 。在北美和西欧，它占周围血管疾病0.75%~5.6%。但在东欧，中东、地中海地区和亚洲，它占周围血管疾病可高达60%~80% [1] 。发病率随着经济发展有下降 [2] ，多数患者伴有营养不良 [3] 。据报道女性的TAO发病率有升高 [1] ，这很可能因年轻女性吸烟的增加。
TAO是一种影响中小型动脉和静脉血管壁的炎症性疾病，伴有血管腔内血栓形成，主要累及肢体。多发生在青壮年男性吸烟者，剧痛导致药物滥用和肢体丧失，国外报道高位截肢率达20% [1] 。近年来其免疫发病机制已引起国内外学者注意，但深入全面研究尚不足。我们于1985年报道了TAO的免疫发病机制主要涉及III型超敏反应，并且与IV型超敏反应有关 [4] 。现进一步对TAO免疫发病机理作深入研究。
2. 临床资料和方法
2.1. 病人
共74例，均为男性；年龄21~50岁；临床病程：2~28年；复发次数：1~6次；最近病期：1至10个月。
TAO的诊断基于以下标准：1) 发病年龄在20~40岁；2) 吸烟；3) 通常伴有肢端游走性浅静脉炎；4) 有肢体缺血症状和体证；5) 必须排除其他外周血管疾病如动脉硬化性闭塞，糖尿病足等。
根据病情将患者分为“进展态”、“迁延态”和“稳定态”。
2.2. 观察和方法
1) 检测体液免疫IgE：采用ELISA法检测无过敏性疾病的28例TAO患者血清IgE。并设有正常人组以资对照。
2) 检测TAO病变血管沉积抗原抗体复合物：对18例TAO患者病变血管(截肢后血管和活扦炎性浅静脉)，用以下3种免疫标记方法同时进行，以确保检测结果的准确性。并设有正常人组以资对照。
a) 免疫荧光法(IF)：TAO血管固定在冷却酒精(95%)中，用低温石蜡包埋，切片使用胰酶消化，免疫荧光染色，采用异硫氰酸荧光素兔抗人免疫球蛋白和免疫球蛋白G (兔抗人FITC-Ig与FITC-IgG)；荧光显微镜下观察TAO病变血管 [5] ；
b) 免疫酶标记染色(ABC)：为了证明IF的结果，并排除非特异性交叉反应，使用了与上述相同的连续切片，ABC免疫酶标记，生物显微镜下观察TAO病变血管；
c) 免疫金银染色(IGSS)：使用与上述相同的连续切片，IGSS免疫标记染色，生物显微镜下观察TAO病变血管 [6] 。
3) 抗血管自身抗体的检测：
使用正常血管(非脉管炎截肢动脉或静脉)作为抗原替代物，将28例TAO患者的血清用作第一抗体，使用兔抗人作为第二抗体。采用以上三种免疫标记同时进行，以确保检测结果的准确性。均采用间接染色方法。设有正常人组对照(血清来自瑞金医院志愿者捐血)和另外5组对照：1) 兔血清替代人血清；2) 缓冲液替代人血清；3) 抗小鼠抗体取代标记抗体；4) 缓冲液替代标记抗体；5) 生理盐水空白。
我们进行了配对的t检验，并确定了均值和标准差。P值 < 0.05被认为具有统计学意义(显著)，P < 0.01非常显著。
3. 结果
1) 体液免疫：TAO患者IgE呈非常明显升高(P < 0.01)；各组均升高，而在“迁延”和“稳定”组明显高于对照组(P < 0.05) (见表1)。
Table 1. Determination value of humoral immune IgE in normal people and TAO patients
表1. 正常人与TAO患者体液免疫IgE测定数值(*P < 0.01, **P < 0.05)
2) 免疫标记后观察病变血管沉积的抗原抗体复合物：
a) 直接免疫荧光(DIF) (见图1)：在血管内膜、中层和外层中可见黄绿色条纹状、斑块状和颗粒状免疫复合物荧光物质的沉积。
Figure 1. Deposits with yellowish-green striped, lumpy and particle-shaped immunofluorescence on TAO vascular wall (DIF 400×)
图1. TAO血管壁上有黄绿色条纹、块状和颗粒状免疫荧光沉积物免疫荧光(DIF 400×)
b) 免疫酶标记染色(ABC) (见图2)：在血管内膜、中层和外层有棕黄色的条纹块状免疫酶标物质的沉积(结果与DIF相同)。
Figure 2. Streaky and massive of brown-yellow immunoenzyme-labeled staining substances deposited on the vessel wall of TAO (ABC 400×)
图2. TAO 血管壁上有条纹状、块状的棕黄色免疫酶标物质的沉积。免疫酶标记染色(ABC 400×)
c) 免疫金银染色技术(IGSS) (见图3)：在血管内膜、中层和外层可见黑色的条纹颗粒状免疫复合物金标物质的沉积。(IGSS的结果与ABC和IF相同，IGSS技术显示出良好的特异性和灵敏度)
Figure 3. Black stripes and granular immune gold and silver staining substances were deposited on blood vessel (IGSS 400×)
图3. TAO血管壁上有黑色条纹颗粒状免疫金标物质的沉积。免疫金银染色(IGSS 400×)
所有上述三种免疫标记技术都显示了血管壁上的抗原抗体复合物沉积，其中IgG和IgM的荧光强度更强。
3) 抗血管自身抗体
通过三种免疫标记技术证明：抗血管自身抗体存在于TAO患者的血清中，占72%~86% (见表2)并見到抗血管的自身抗体直接与血管胶原蛋白结合(如图4~6所示)。IGSS方法的特异性和敏感性优于DIF和ABC方法。
Table 2. Detection of antivascular autoantibodies in serum of TAO patients
表2. 检测TAO患者血清中的抗血管自身抗体
*正常组是指瑞金医院志愿捐血者。**5种对照均为阴性：兔血清替代人血清；缓冲液替代人血清；抗小鼠抗体取代标记抗体；缓冲液替代标记抗体；空白。
Figure 4. Antivascular antibodies are present in the sera of TAO patients, showing that the secondary antibody yellow-green FITC-antibody binds to the vessel wall (DIF 200×)
图4. 在TAO患者的血清中存在抗血管抗体，显示第二抗体黄绿色FITC-抗体与血管壁结合(DIF 200×)
Figure 5. Antivascular antibodies are present in the sera of TAO patients, showing that the second antibody brown red ABC-antibody binds to the vessel wall (ABC 200×)
图5. 在TAO患者的血清中存在抗血管自身抗体，显示第二抗体棕红色ABC-抗体与血管壁结合(ABC 200×)
Figure 6. Antivascular antibodies are present in the sera of TAO patients, showing secondary antibody dark brown Gold-antibody bound to vessel wall (IGSS 200×)
图6. TAO患者血清中存在抗血管自身抗体，显示第二抗体深棕色Gold-抗体与血管壁结合(IGSS 200×)
4. 讨论
自1962年，Pokorny报道，在TAO并发游走性浅静脉炎者血清中检出抗血管抗体以来 [7] ，TAO免疫学的研究在逐渐展开。
80年代，国内学者王嘉桔，郑萍，王万超，杨博华、于爱莲等也开始进行TAO的免疫学研究 [4] [8] [9] 。
郑萍，王万超等以体液免疫(γ球蛋白，免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、補体CH50、C3、C4、免疫复合物CIC)；细胞免疫(T细胞花环试验E-RFC、T抑制细胞As、表面带有SmIg、SmIgG的外周B淋巴细
注：郑萍，王万超1985年原创，2020年修改。
Figure 7. Conceptual diagram of the pathogenesis of thromboangiitis obliterans
图7. 血栓闭塞性脉管炎发病机理构思图
胞、白细胞移动抑制试验LMIT)和免疫病理(光镜、免疫荧光、透射电镜)为指标，较系统地观察了30例TAO患者及其处于发展、迁延、稳定状态的免疫学改变，其研究结果显示：体液免疫中γ球蛋白升高、IgG升高、CIC升高，且在病情处于发展状态时，显示非常显著差异(P < 0.01)，自身抗体(抗血管IgG抗体)存在，并见到免疫荧光复合物沉积于血管壁，B细胞升高，T细胞尤其是T抑制细胞降低等表现，提示TAO是一个与抗原抗体复合物形成并沉积于血管壁的III型超敏反应有关的自身免疫病 [4] ，同时，根据临床TAO患者有反复浅静脉炎结节发作，结节表面皮肤炎症水肿，可能为致敏淋巴细胞释放淋巴因子所致，根据病理光镜下显示以淋巴细胞浸润为主，且结合LMIT的结果还表明：TAO患者的淋巴细胞确可被变性主动脉的抗原致敏，并使白细胞移动抑制加强，故考虑在TAO的免疫发病机理中，除III型超敏反应，尚有IV型迟发超敏反应的参与 [4] 。
近年来，不少学者在TAO中发现了多种抗体：抗内皮细胞抗体(AECA) [10] ，抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA) [11] ，抗磷脂抗体(APA) [12] [13] ，G蛋白受体抗体(AAB) [14] 等，提示多种抗体可攻击血管内皮细胞和血管壁。并有报道各种细胞因子、E-选择素、白介素等对血管免疫反应的作用 [15] [16] 。国内伏祥茂等通过测定患者红细胞膜上C3b受体活性及红细胞免疫调节因子活性，发现TAO患者它们的活性均显著下降，红细胞具有调节机体免疫的多种功能，C3b受体能与循环中的免疫复合物粘附、运转、清除，其活性的下降，使清除免疫复合物(CIC)的能力下降 [17] 。郭轶等研究TAO患者的T淋巴细胞对管壁的浸润，引起免疫损伤 [18] ；Peter等在临床上使用免疫吸附法均获得正面效果 [19] [20] 。作者于85年创制的含少量免疫抑制作用的西药小复方也获得临床上不错的疗效。
本研究示TAO患者体液免疫IgE非常显著升高(P < 0.01)。结合临床，TAO有反复急性发作，发作有一定诱因(烟草、气候、外伤、营养不良等) [3] ，患者似发于致敏状态，提示有I型超敏反应的存在，或IgE升高正是其自身免疫性疾病的一种表现 [21] 。本研究还通过三种免疫标记方法均证明TAO患者血清中有抗血管自身抗体的存在(高达72%~89%)，并直接观察到抗原抗体复合物沉积在血管壁上，再次鉴定了III型超敏反应的存在。还观察到抗血管自身抗体直接与病损的血管胶原结合，显示II型超敏反应的存在。
根据1985年我们先前的研究结果 [4] 结合本次研究表明，TAO具有了以下自身免疫疾病的特点：高r球蛋白血症；存在自身抗体和致敏淋巴细胞；抗原抗体复合物在受损组织中的沉积；淋巴细胞、浆细胞、单核细胞浸润在靶器官中；国内外学者并发现TAO病人有多种自身抗体；与遗传基因有关 [22] 。结合临床，病情呈反复发作和慢性迁延过程；在急性发作时，免疫吸附法和使用免疫抑制剂对病情有较好的控制；四肢和内脏TAO同时存在 [23] [24] ；疾病发生有明显诱因，吸烟被公认为是TAO的主要发病因素，不仅烟雾可直接致敏，尼古丁还能作为半抗原，其与细胞内的组蛋白或DNA结合，使自身组织成分发生改变，导致自身抗体的产生 [25] ；性激素变化可导致自身免疫疾病 [26] ，TAO患者94.5%~99%均为青壮年男性。
总之，我们的研究发现了TAO是属于涉及多种超敏反应的自身免疫性疾病。主要为III型超敏，除IV型外还有II型超敏，并提示I型超敏反应的涉及。TAO的血管壁炎症、血液高凝状态 [27] 和血管腔中的血栓形成可以被认为是其多种超敏反应的后果(见图7)。
致谢
我们衷心感谢上海市免疫研究所黎力、谢雅莉、黄冬生在某些免疫技术上的协助和马宝骊的指导；感谢上海交通大学医学院数学教研组苏炳华的数据统计；更感谢中国中西医结合周围血管病委员会主任杨博华的鼓励与肯定。
参考文献
NOTES
*通讯作者Email: Portiaz@126.com
#Email: wcwang40@gmail.com