DMD基因内含子突变致Becker型肌营养不良1例报告并文献复习

Becker Muscular Dystrophy Caused by an Intron Mutation in the DMD Gene: A Case Report and Literature Review

摘要: 目的：探讨DMD基因内含子突变所致Becker型肌营养不良(BMD)的临床表现及基因变异特征。方法：回顾分析1例确诊BMD患儿的临床资料、肌肉病理及基因检测结果并复习相关文献。结果：患儿，男，12岁，2年前活动后出现乏力伴双下肢不适感，小便如茶色，急性期肌酸激酶、肌红蛋白水平可升高至正常值100倍以上；尿液分析示隐血3+，红细胞计数正常；代谢缺陷筛查(血、尿有机酸分析)无异常。后患儿乏力及尿液异常反复发生，全外显子检测无DMD基因相关突变；肌肉病理示骨骼肌呈肌病样改变，Dystrophin表达下降；DMD基因mRNA测序示存在异常剪接。患儿最终确诊为BMD。结论：反复横纹肌溶解的患者亦应考虑BMD的可能；对DMD基因外显子检测无异常，但Dystrophin表达异常的患者，需警惕内含子突变所致基因异常剪接。

Abstract: Objective: To investigate the clinical manifestation and gene variation of Becker muscular dystro-phy (BMD) caused by intron mutation of DMD gene. Methods: The clinical data, muscle pathology and gene detection results of one child with confirmed BMD were analyzed retrospectively and the related literature was reviewed. Results: A 12-year-old male patient developed fatigue with dis-comfort in both lower limbs after activity 2 years ago, with a brown urine color. In the acute phase, the levels of creatine kinase and myoglobin can increase to over 100 times the normal value; Urine analysis showed occult blood 3+ and normal red blood cell count; Metabolic defect screening (blood and urine organic acid analysis) showed no abnormalities. The patient experienced recurrent fa-tigue and urinary abnormalities, and no DMD gene related mutations were detected in the whole exon; Muscle pathology showed myopathic changes in skeletal muscles, with a decreased expres-sion of dystrophin. The mRNA sequencing of the DMD gene showed abnormal splicing. The patient was ultimately diagnosed with BMD. Conclusion: Patients with recurrent rhabdomyolysis should also consider the possibility of BMD; patients with DMD gene exon detection without abnormalities, but dystrophin expression abnormalities, should be vigilant for gene splicing caused by intron mu-tations.

1. 引言

Becker型肌营养不良(Becker muscular dystrophy, BMD)属于假肥大型肌营养不良的一种，是由于抗肌萎缩蛋白(dystrophin, DMD)基因变异引起的以进行性肌无力、腓肠肌假性肥大、血清肌酸激酶(creatine kinase, CK)水平升高为主要特征的遗传性肌病 [1] 。横纹肌溶解为BMD的罕见临床表现 [2] ，国内尚未见报道。目前确诊的BMD多数为DMD基因外显子突变所致，因内含子突变致病者鲜有报道。2020年，我院儿童医学中心接诊了1例反复横纹肌溶解的患儿，后证实为DMD基因内含子突变所致BMD。现对其临床特征及基因突变情况进行分析，并结合国内外相关文献进行分析总结，以期提高对BMD的认识。

2. 病例报告

患儿，男，12岁，于2020年4月8日因“乏力8小时，胸闷、憋气伴尿色深4小时”就诊于医院。8小时前患儿爬山时出现乏力，主要为双下肢不适感、双侧腓肠肌明显，休息后可缓解；无肢体活动障碍，无发热、抽搐。4小时前患儿跳绳(约2分钟)后出现胸闷、憋气，无胸痛，无面色青紫或苍白，无头晕、头痛，即入我院急诊，留取尿液时发现小便如茶色，尿液分析：隐血3+，红细胞计数0.5/μl；血肌酸激酶：98862.00 U/L，肌红蛋白 > 12000.00 ng/ml。入院后予完善相关辅助检查，诊断为横纹肌溶解，予水化碱化、利尿等治疗3天，患儿乏力消失、尿检正常出院。此后，患儿活动后乏力及尿液异常反复发生。

患儿平素体质一般，3~4岁起走路易跌到，活动后易疲劳，以上情况2~6月出现1次；7岁开始无步行跌到情况，但步行300~400米后需短暂休息5分钟左右，每年出现2~3次；间断诉有双下肢不适，休息后可消失，曾就诊我院门诊，考虑为生长痛，予口服补钙治疗效果欠佳。家属否认患儿起病前有感染、外伤、服用药物等病史。患儿系第2胎第1产，足月剖宫产，无产伤，无窒息史。3个月抬头，4个月翻身，6个月会坐，8个月会爬，14个月会走，2岁喊爸妈。智力发育与同龄儿相符。父母健康，否认近亲结婚。母亲孕期健康。有1弟弟，体健。否认家族中有同类疾病史，否认家族性遗传代谢病史。体格检查：体温：36.2℃，脉搏：94次/分，呼吸：25次/分，体重：60 kg，血压：121/77 mmHg。神志清，精神可，正常面容，语言流利，对答切题，营养良好；心肺腹查体无异常；双侧腓肠肌无明显肥大，局部无肌肉压痛，颈屈5-级，肩内收、外展5-级，伸屈肘5-级，伸腕5-级，屈腕5级，屈髋5-级，髋内收、外展5级，伸膝、屈膝5级，足背伸、跖屈5级，Gower征阴性，病理征阴性。实验室检查：发作期：多次于发作期查尿液分析示隐血1+~3+、红细胞计数正常；血肌酸激酶12210.00~98862.00 U/L，肌红蛋白1200.00~12000.00 ng/ml，谷丙转氨酶：136.00~353.48，谷草转氨酶：374.71~946.00；发作间期：肌酸激酶1409.00~6661.00 U/L，肌红蛋白水平正常，谷丙转氨酶：80.9~103 U/L，谷草转氨酶：40.50~58.80 U/L。血常规、电解质、肾功能、红细胞沉降率、甲状腺功能、细胞因子、Coombs实验未见明显异常；心电图示窦性心律；心脏超声示结构、血流及功能未见异常；代谢缺陷筛查(血、尿有机酸分析)无异常；双下肢MR示各肌群内见多发斑片状高信号影，符合横纹肌溶解症改变(图1)。肌电图检查未见明显异常改变。

Figure 1. Patchy high density shadow of tibialis anterior muscle and gastrocnemius muscle muscle

图1. 胫骨前肌、腓肠肌斑片状高密度影

患儿反复发生横纹肌溶解，且起病前无感染、外伤、服用药物等诱因，考虑存在遗传相关疾病。经家属知情同意及医院伦理委员会审批，签署基因检测知情同意书，送第三方检验机构(北京迈基诺基因检测公司)行全外显子检测，发现2个可疑致病基因突变：RYR1基因：c.7099G > A (p.A2367T) (母源，LP)，c.11683A > G (p.N3895D) (父源，VUS)；BTBD13基因：c.180_193del (p.T61fs*79) (父源，LP)。后行肌肉活检(左肱二头肌)病理检查：骨骼肌少数肌纤维出现坏死、再生，符合坏死性肌病样改变。肌肉酶组织化学检查：PAS染色未见明显异常，NADH-TR染色未见明显异常，SDH染色未见RBF及SSV，COX染色未见COX阴性肌纤维。免疫组织化学染色(抗肌萎缩蛋白-N、C、R)：抗肌萎缩蛋白-N染色显示个别肌纤维膜轻度表达下降；抗肌萎缩蛋白-C染色显示部分肌纤维膜轻度表达下降；抗肌萎缩蛋白-R染色显示肌纤维膜均匀阳性表达。提示抗肌萎缩蛋白相关疾病的可能。完善DMD基因(肌肉组织) mRNA测序检测示该样本在DMD基因转录本1-79号外显子区域存在三种剪切方式，1) 一种剪切方式在19、20号外显子之间插入133 bp碱基，2) 一种剪切方式缺失71号外显子，3) 一种剪切方式正常(图2)。综合患儿临床表现、肌肉病理及基因检测结果，诊断为BMD。

(a)：剪切方式：19、20号外显子之间插入部分内含子碱基；(b)：剪切方式：19、20号外显子之间插入部分内含子碱基；(c)：剪切方式：正常剪切；(d)：剪切方式：缺失71号外显子。

Figure 2. Three splicing modes in the exon 1-79 region of the DMD gene transcript in patients

图2. 患者在DMD基因转录本1-79号外显子区域的三种剪切方式

3. 讨论

根据临床症状的严重程度、进展速度及预后情况，假肥大型肌营养不良可分为Becker型肌营养不良(Becker muscular dystrophy, BMD)和Duchenne型肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy, DMD) [3] 。DMD患儿通常表现为走路晚、走路慢、易摔倒，大多数在3岁左右开始出现进行性肌萎缩，并且在10~12岁丧失独立行走能力，一般在30岁左右死于心脏或呼吸衰竭 [4] 。BMD的临床过程与DMD相似，起病年龄较DMD晚，常在12岁以后起病，病情较轻且进展缓慢，病程可达25年以上，20岁以后仍能行走，且预后良好。但BMD在临床表现上有很大的异质性，除进行性肌无力、腓肠肌假性肥大、高CK等典型表现，此外也有劳力性肌痛、横纹肌溶解、转氨酶升高、进行性的认知异常等不典型表现 [2] 。通过检索既往文献，国外已报道以横纹肌溶解起病的BMD/DMD有13例 [5] - [14] ，本例以横纹肌溶解起病的BMD患儿，为国内首次报道。

BMD的致病基因是DMD基因，位于Xp21.2，全长约2200 kb，是目前已知最大的人类基因，包含79个外显子、78个内含子、7个启动子，其中99%的基因序列由内含子构成 [15] 。由于DMD基因序列之长，故其突变频率高，突变形式复杂，约60.2%为大片段缺失，9.6%为大片段重复，23%为点突变(50%无义突变、14.6%剪接位点突变、36.5%插入/缺失)，7%阴性结果 [16] ，阴性结果的可能原因是由于目前技术等限制导致DMD基因中的内含子变异及其他复杂变异难以被检测、识别 [17] [18] 。DMD基因编码抗肌萎缩蛋白，是一种细胞骨架蛋白，主要分布在骨骼肌、心肌细胞膜下，该蛋白编码3465个氨基酸，根据功能不同分为4个结构域，分别是N末端肌动蛋白结合域(第2~8外显子)、中央棒状结构域(第8~61外显子)、富含半胱氨酸的结构域(第63~69外显子)、C末端结构域(第70~79外显子) [19] 。本文检索的13例以横纹肌溶解起病的患者，其中3例女性DMD携带者，突变类型为大片段缺失、重复 [9] [11] [13] 。其余10例均为男性，仅6例患者有完整的临床及基因检测资料。1992年Carlo Doriguzzi等报道了1例BMD男童，主要表现为运动后肌痛、复发性横纹肌溶解，基因检测示DMD基因第45~48外显子缺失 [5] 。C. Minetti等人报道了1例BMD男孩，表现为单一的横纹肌溶解，查体有小腿轻度肥大、Gower征，基因检测示DMD基因3~6号外显子缺失 [10] 。2010年Aravindhan Veerapandiyan等报道了2例BMD男童，主要表现为运动后肌痛、肌肉僵硬、复发性横纹肌溶解，其DMD基因突变类型为15号外显子点突变(c.1724T > C) [14] 。Dr. Jong-Mok Lee报道了1例主要表现为劳力性横纹肌溶解、活动耐力下降的BMD男童，DMD基因突变类型是发生在N端肌动蛋白结合域的点突变(c.119T > A) [7] ，其余2例以横纹肌溶解起病的患者DMD基因变异均为中央棒状结构域的大片段缺失 [8] [12] 。由此可见，以横纹肌溶解起病的BMD/DMD患者的DMD基因突变类型多样，突变多发生在中央棒状结构域与N端肌动蛋白结合域。

横纹肌溶解是由肌肉组织的分解和坏死而导致的一种病理状态，它会引起CK、肌红蛋白、天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶等肌细胞内物质释放入血 [20] 。近一半的横纹肌溶解症患者表现为典型的三联征：肌肉疼痛、乏力和深色尿 [21] [22] 。横纹肌溶解症有多种原因，其主要原因是后天因素，即剧烈活动、挤压损伤、组织缺血、药物和毒素 [14] [23] [24] 。但在以下情况下应考虑潜在的遗传因素：1) 反复发作的横纹肌溶解症，2) 由极少量运动、发热、高温或寒冷暴露或禁食引起的横纹肌溶解症，3) 既往恶性高热病史，4) 有横纹肌溶解、恶性高热、肌病或肌营养不良的家族史，5) 发作时伴有劳力性肌痛、肌肉痉挛、四肢无力、肌肉肥大或萎缩的患者 [25] 。本例患儿近2年活动后横纹肌溶解反复发生，且无肌病家族史，既往无恶性高热史，应警惕遗传相关性疾病，包括代谢性肌病、RYR1相关肌病和不太常见的肌营养不良。遗传代谢性肌病是儿童复发性横纹肌溶解的最主要原因 [25] 。其特点是肌肉细胞内能量供应异常，主要与糖原、脂质或线粒体代谢异常以及基因异常有关。该患儿代谢缺陷筛查(血、尿有机酸分析)无异常，肌肉酶组织化学检查未见明显异常。全外显子基因检测未见代谢性肌病相关基因突变，考虑代谢性肌病可能性小。RYR1相关肌病包括多微小轴空病、恶性高热易感1型(MHS)、中央轴空病。近年来，研究表明MHS相关的RYR1突变已成为横纹肌溶解和或劳力性肌痛的常见原因 [26] ，MHS易感者骨骼肌细胞内肌浆网膜存在先天缺陷，平素无异常表现，在诱发因素诸如运动、发热、病毒感染、酒精、麻醉药物等作用下可出现骨骼肌强直收缩，从而出现横纹肌溶解 [27] 。MHS易感人群除对以上诱发因子敏感外，其他临床表型与正常人群无异。本例患儿虽反复横纹肌溶解发作、全外显子测序显示RYR1基因可疑致病突变，但该患儿起病前无明显诱因，发作间期亦表现活动耐力下降，免疫组化提示抗肌萎缩蛋白病。临床表型上不支持MHS相关的RYR1突变。

本例患儿呈慢性病程，以反复横纹肌溶解、活动耐力下降为主要表现，CK水平显著升高，代谢缺陷筛查(血、尿有机酸分析)及基因检测不支持代谢性疾病，故考虑遗传相关性肌病可能。患儿全外显子测序，发现2个可疑致病基因突变：RYR1基因、KBTBD13基因，MHS相关的RYR1突变虽可引起横纹肌溶解，但所发现的突变临床表型不支持。KBTBD13基因突变所致杆状体肌病6型，仅有运动不耐受、进行性近端肌无力、动作缓慢伴肌肉僵硬等肌病表现，该突变临床表型不支持且不符合遗传共分离。后完善肌肉活检病理检查符合坏死性肌病样病理改变。免疫组化提示肌细胞抗肌萎缩蛋白表达下降，提示抗肌萎缩蛋白病可能。该患儿肌肉活检抗肌萎缩蛋白表达下降，提示DMD或BMD可能。蛋白结构的差异提示编码基因的缺陷，而该患儿全外显子检测并未发现DMD基因相关突变，考虑存在外显子以外的基因编码异常。患儿肌肉组织的DMD基因mRNA测序显示存在三种剪切方式：一是19、20号外显子之间插入133 bp碱基；二是缺失71号外显子；三是剪切方式正常。其中存在正常剪切方式，与该患儿临床表现轻微相吻合；第71号外显子缺失方面，因第71号外显子长度很短，且目前无单纯DMD基因71号外显子缺失的致病记录，考虑该突变体致病可能性小；而在19、20号外显子中插入133 bp碱基的原因，考虑为内含子突变产生了新的转录起始位点、从而引起了异常剪接，而插入的133 bp碱基是来源于19号内含子。因此，该剪切方式是导致抗肌萎缩蛋白表达下降的原因。目前尚未发现内含子突变致BMD/DMD者表现为横纹肌溶解，本病例丰富了BMD/DMD患者横纹肌溶解表现的变异谱。

通过本病例，可以给我们如下启示：BMD/DMD患儿亦可表现为横纹肌溶解，特别是对于反复发生横纹肌溶解的患儿，应警惕BMD/DMD的可能；对于外显子基因测序未提示有DMD基因无异常、而肌肉活检显示抗肌萎缩蛋白表达下降时，应考虑内含子突变的可能。针对性的mRNA测序可能为进一步明确基因突变位置提供线索。

NOTES

^*通讯作者。