NLRP3、氧化应激在动脉粥样硬化中作用

The Role of NLRP3 and Oxidative Stress in Atherosclerosis

摘要: 动脉粥样硬化(AS)是冠心病(CHD)、脑梗死等心脑血管事件发生的重要病理生理基础，是一种慢性适应不良，由内皮功能障碍和内皮下脂蛋白聚集的相互作用引起，而且是不可逆转的炎症性疾病。近年来研究显示，作为炎性小体核心的NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3 (NLRP3)，其活化及活性调节在AS进程中具有重要的生理病理学意义。动脉粥样硬化的炎症性质已被证实，但关于激发动脉壁炎症的因子仍在很大程度上未知。在动脉粥样硬化形成过程中，有几种假说与动脉狭窄相关。氧化修饰假说与氧化和抗氧化失衡有关，是研究最多的假说。本文基于文献资料，探讨分析了NLRP3炎症小体和氧化应激对动脉粥样硬化发生发展的影响。

Abstract: Atherosclerosis (AS) is an important pathophysiological basis for cardiovascular and cerebrovascu-lar events such as coronary heart disease (CHD) and cerebral infarction, and is a chronic maladapta-tion, caused by the interaction of endothelial dysfunction and subendothelial lipoprotein aggrega-tion, and is an irreversible inflammatory disease. In recent years, studies have shown that the acti-vation and activity regulation of pyrin-containing domain protein 3 (NLRP3), a family of NOD-like receptors as the core of inflammosomes, have important physiopathological significance in the pro-cess of AS. The inflammatory properties of atherosclerosis have been confirmed, but the factors that provoke inflammation of arterial walls remain largely unknown. During atherosclerotic formation, several hypotheses are associated with arterial stenosis. The oxidative modification hypothesis is related to oxidation and antioxidant imbalance and is the most studied hypothesis. Based on liter-ature, this paper analyzes the effects of NLRP3 inflammasome and oxidative stress on the occur-rence and development of atherosclerosis.

1. NLRP3炎症小体结构组成

NLRP3 (NOD-like receptor protein 3, NLRP3)炎症小体的组成部分由NLRP3是一种重要的细胞内模式识别受体蛋白、接头蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶招募域(ASC)和效应蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶原-1 (pro-caspase-1)构成 ‎[1] 。NLRP3包含N端pyrin结构域(PYD)、中央核苷酸结合寡聚结构域(NACHT结构域)和C端富含亮氨酸重复结构域(LRRs) ‎[2] 。ASC是由半胱氨酸天门冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)募集域(PYD和CARD)组成的衔接部分，通过它分别与NLRP3和Caspase-1相互作用 ‎[3] ‎[4] 。活化后，procaspase-1通过质膜中的gasdermin-D孔介导生物活性白细胞介素-1β (IL-1β)和白细胞介素-18 (IL-18)的切割和分泌 ‎[5] 。在生理状态下，NLRP3炎症小体促炎反应是机体的保护性机制，维持NLRP3炎症小体活化稳态对于防治炎症相关性疾病相当重要 ‎[6] 。病理状态下，NLRP3炎症小体因为被各种因素过度激活，所以在多种与炎性相关的AS发展过程中起到重要的促炎调控作用。

1.1. NLRP3炎症小体活化途径

NLRP3炎症小体的激活需依赖两个信号，即启动和激活。第一个信号启动信号，是由激活的Toll样受体通过髓样分化因子接头分子活化的核因子-κB (NF-κB)等多种转录因子，经细胞内模式识别受体途径识别病原体相关的分子模式和损伤相关的分子模式，进而激活NLRP3以及pro-IL-1β和pro-IL-18的转录 ‎[7] 。第二个信号是Caspase-1的激活。有多种刺激可以激活NLRP3炎性体。包括细菌和真菌成分和毒素、病原体相关RNA、ATP、K⁺离子团、活性氧(ROS)或溶酶体损伤 ‎[3] ‎[8] ‎[9] 。活性NLRP3招募pro-caspase-1，并将其切割成活性形式。Caspase-1将IL-1β和IL-18分别转化为它们的活性形式IL-1β和IL-18，进一步被分泌到细胞外空间，在那里它们执行其进一步的免疫功能 ‎[3] 。

还有一个“非典型”NLRP3炎性体激活通道。迪克西特和邵等人相继发现人的caspase-4/5或小鼠的caspase-11以高特异性和亲和力直接与位于革兰氏阴性细菌外膜的脂多糖(LPS)的脂质A结合，诱导其自身的寡聚和激活 ‎[10] ‎[11] ，caspase-11诱导焦亡，一种程序性细胞死亡形式，并特异性地防御侵入细胞质的细菌病原体。然而，在内毒素血症期间，过量的caspase-11活化会导致休克，LPS对细胞质的污染是触发小鼠caspase-11活化的信号。具体而言，caspase-11对五酰化和六酰化脂质A有反应，而四酰化脂质A未被检测到，为细胞质溶胶侵袭性弗朗西塞拉提供了一种逃避机制。在体内启动caspase-11途径导致野生型和Tlr4缺陷小鼠对随后的LPS攻击极为敏感，而Casp11缺陷小鼠相对耐药 ‎[12] 。人的caspase-4或caspase-5和小鼠的caspase-11能够感应细胞内LPS的发现改进了我们以前对革兰氏阴性病原体宿主监测的认识 ‎[13] 。

1.2. NLRP3炎症小体对动脉粥样硬化发生发展的影响

AS的斑块核心被一层富含胶原的基质和被内皮细胞覆盖的平滑肌细胞所包围，称为纤维帽 ‎[14] 。细胞内外的脂质沉积是触发动脉粥样硬化的关键因素，泡沫细胞的出现和聚集是形成动脉粥样硬化斑块的原始原因 ‎[15] 。由于血液中脂质在动脉内膜沉积，平滑肌细胞和结缔组织增生引起的血管内膜增厚、动脉壁变硬、管腔狭窄。AS是一种慢性炎症反应性疾病，广泛的被免疫细胞浸润、脂质沉积和血管平滑肌细胞的增生都会导致动脉壁粥样硬化斑块的形成。尤其是，NLRP3炎症小体成分如NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18在动脉粥样硬化斑块中的高表达提示NLRP3与AS的发病机制有关 ‎[16] 。

在机制上，低密度脂蛋白(LDL)、胆固醇晶体(CCs)和磷酸钙晶体是激活AS中NLRP3炎症小体的主要驱动因素，并与不稳定的斑块和预后不良有关。NLRP3炎症小体将脂质及脂蛋白在动脉中的沉积与介导动脉粥样硬化发生发展的炎症反应联系在一起 ‎[17] 。单核细胞在内皮下分化形成的巨噬细胞吞噬氧化修饰低密度脂蛋白(oxidized lodensity lip-oprotein, oxLDL)并激活NLRP3炎症小体，导致泡沫细胞形成及胆固醇结晶体积累，使得NLRP3炎症小体在动脉粥样硬化病变早期发挥着重要作用 ‎[18] 。oxLDL与脂肪转位酶CD36结合介导微血管内皮细胞炎症反应的发生，影响ROS生成、钾流出和组织蛋白酶B活性，进一步促进了NLRP3炎症小体激活和炎症因子的成熟分泌，参与泡沫细胞形成和动脉粥样硬化发展 ‎[19] 。从而表明oxLDL在NLRP3炎症小体启动和激活过程中具有双重作用，成为动脉粥样硬化发展的主要驱动力。胆固醇结晶除具有机械和毒性作用，还通过引发炎症反应来诱导动脉壁损伤，诱导细胞死亡并造成纤维帽穿孔，出现斑块破裂、出血及血栓形成等一系列变化 ‎[17] 。总之，脂质与NLRP3炎症小体间相互作用诱导不可逆转的炎症反应是动脉粥样硬化病变的基础。

NLRP3炎症小体激活的另一个后果是诱导了细胞的凋亡，促炎细胞死亡导致IL-1β和IL-18产生和释放的增加，进一步维持促炎环境 ‎[20] 。NLRP3炎症小体过活化也与糖尿病患者的动脉粥样硬化有关，在糖尿病动脉粥样硬化小鼠模型中 ‎[21] ，NLRP3炎症小体的敲除不仅降低动脉粥样硬化斑块而且使其变得稳定。IL-1β则被认为是由平滑肌细胞、血管内皮细胞和造血细胞在炎症条件下产生的，在炎症条件下，IL-1β还可以诱导增殖，并在动脉粥样硬化的过程中起到重要炎症作用 ‎[22] 。此外，NLRP3炎症小体的产物IL-18过度表达也助于动脉粥样硬化的发生。

2. 氧化应激

氧化应激指的是氧化剂和抗氧化防御之间的失衡，这种失衡可能会对生物系统造成损害。后来的研究中，氧化还原生物学领域逐渐从病理中的氧化应激概念发展到生理中的氧化还原信 ‎[23] 。心血管疾病是一种具有异质性病理生理机制的复杂疾病，氧化应激的增加已被视为潜在的常见病因之一。

2.1. 氧化应激机制

ROS是由氧还原生成的具有高反应性的含氧物种 ‎[24] 。包括自由基物种，如超氧化物( ${\text{O}}_2^{-}$ )和HO⁻和非自由基物种，如H₂O₂。形成后，也可以产生更复杂的物种，如ONOO⁻、次氯酸(HOCL)和脂质过氧基。ONOO⁻可与二氧化碳反应生成反应性很强的硝基亚精氧碳酸酯。生理水平的ROS是维持控制细胞过程如炎症、分化、增殖和凋亡的信号通路所必需的。ROS诱导的脂质过氧化在细胞死亡中起关键作用，包括细胞凋亡、自噬和铁死亡 ‎[25] 。

心血管危险因素导致NADPH氧化酶、黄嘌呤氧化酶、线粒体电子传递链和功能失调的内皮一氧化氮合酶产生的ROS的产生增强 ‎[26] 。当超过抗氧化防御系统，例如超氧化物歧化酶，过氧化氢酶，谷胱甘肽过氧化物酶，血红素加氧酶，对氧磷酶的能力时，这会导致氧化应激，从而促进动脉粥样硬化生成 ‎[26] 。在许多疾病中，氧化应激是由其他因素引起的继发病理反应。例如，在最初的组织损伤后的炎症反应中，NADPH氧化酶产生的 ${\text{O}}_2^{-}$ 或H₂O₂增加引起氧化应激，以及缺血–再灌注中黄嘌呤氧化酶引起的氧化应激。氧化应激可通过修饰蛋白质、促进炎症、诱导细胞凋亡、自噬失调、线粒体功能受损等机制，干扰多种信号通路，影响多种生物学过程。这些影响往往加速病理进展和加剧疾病症状 ‎[27] 。

2.2. 氧化应激对动脉粥样硬化的影响

在动脉粥样硬化中，斑块积聚在动脉内膜层，随着时间的推移，动脉变窄，导致梗死和中风。大量证据表明，氧化应激在动脉粥样硬化的发病机制中起着重要作用。自从首次在人类动脉粥样硬化的主动脉中发现脂质氢过氧化物以来 ‎[28] 。许多研究表明在动脉粥样硬化病变中氧化脂质和其他氧化应激标志物的增加。

血管内皮细胞是一氧化氮(NO)产生的主要场所。NO对血管舒张的调节是血管系统中最重要的动脉粥样硬化防御机制 ‎[29] 。腺苷5-单磷酸依赖的蛋白激酶(AMPK)作为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)负调节剂，通过降低NOX的表达，进而预防血管进一步氧化损伤和内皮功能障碍，是他汀类药物作用靶标之一 ‎[30] 。NO能激活AMPK通路，促进内皮的祖细胞动员并向内皮细胞分化，用来修复内皮细胞的损伤。氧化损伤会引起NO减少，AMPK通路的抑制，将导致内皮细胞的修复，为粥样硬化形成提供有利条件。除导致NOX增加外，氧化应激引起黄嘌呤氧化酶、环氧合酶、脂氧合酶、髓过氧化物酶和细胞色素P450单加氧酶等多种氧化酶上调，产生大量ROS，均能够迅速与NO结合，形成高活性的过氧亚硝酸盐中间体，导致NO含量和生物利用率降低 ‎[31] ，同时促进蛋白质硝化，引起内皮功能障碍和死亡。过量ROS干扰内皮细胞NO信号传导、介导NO合酶解耦连 ‎[32] ，使内皮细胞介导的血管舒张和收缩功能紊乱，血管壁张力增加，加速粥样硬化形成。OX-LDL具有显著细胞毒性，很容易被巨噬细胞和平滑肌细胞吞噬，引起胆固醇积聚和泡沫细胞形成，是动脉粥样硬化形成的最主要驱动因素。过度氧化是LDL形成oX-LDL的主要原因 ‎[33] 。

2.3. 信号素-3a及其他抗氧化治疗对动脉粥样硬化治疗影响

信号素-3a (Sema3A)是一种特殊的膜相关分泌蛋白，具有各种生物学特性，如促炎、抗肿瘤等。一项研究旨在探讨抑制Sema3A对LPS诱导的小鼠血管损伤的影响 ‎[34] 。将小鼠随机分为三组：对照组，LPS组和LPS + siRNA。联合组小鼠经快速尾静脉注射给予siRNA，7天后腹腔注射LPS，24小时后对小鼠实施安乐死。通过血管损伤生物标志物和相关染色评估血管功能和结构。LPS诱导的血管功能障碍和病理损伤通过抑制Sema3A得到显着改善。LPS刺激后炎症细胞因子(IL-1β、IL-6和NLRP3)水平上调，然而，Sema3A的抑制通过NF-κB和MAPKs信号通路参与逆转了它。此外，抑制Sema3A减轻了LPS诱导的氧化应激，这可以通过总活性氧的减少和SOD-1抗氧化蛋白的增加来证明。结果表明，抑制Sema3A通过抑制血管内皮细胞活化、血管炎症和血管氧化应激来防止LPS诱导的血管损伤，这意味着抑制Sema3A可作为脓毒性血管损伤或AS的治疗策略 ‎[35] 。除了天然或合成抗氧化剂外，心血管和代谢疾病患者的常规治疗方法也正在开发新的治疗方案，可以影响氧化还原稳态。主要的抗氧化治疗策略包括：激活内源性防御抗氧化系统，抑制氧化应激的产生，以及产生能够修复ROS诱导损伤的产物转录因子核因子(红细胞衍生的2，NRF2)是一种能增强内源性抗氧化防御系统的基本转录因子。NRF2表达和活性的降低与动脉粥样硬化和高血压易感性的增加有关。在NRF2基因敲除小鼠中，发现心力衰竭易感性增加 ‎[36] 。富马酸二甲酯是研究最多的作用于NRF2的药物。在载脂蛋白E缺陷小鼠模型中，经证实可减轻缺血/再灌注损伤 ‎[37] ，并可减少AS的发展 ‎[38] 。

3. 展望

AS的发生发展是一个多因素共同作用的病理过程，其发病机制复杂，虽然较多的研究证实了NLRP3炎症小体主要通过调控IL-1β、IL-18等下游细胞因子的释放，介导AS中的炎症反应，但当前对NLRP3炎症小体在AS中的作用具体的分子机制研究相对较少，以及是否存在其他通路共同干预等还尚未可知，在AS的作用机制仍需进一步研究。新的抗氧化剂可能代表了另一种未来的前景，特别是那些针对活性氧的主要来源线粒体等特定细胞器的活性的抗氧化剂。因此，本文从NLRP3炎症小体和氧化应激角度，综述和探讨了其相关反应在AS中的调控机制。