灵芝多糖通过增加Nrf2、降低IL-1阻止糖尿病肾病的铁死亡

Ganoderma lucidum Polysaccharide Prevented Ferroptosis in Diabetes Nephropathy by Inhibiting IL-1 and Enhancing Nrf2

摘要: 目的：铁死亡导致多种急性、慢性肾损伤，包括糖尿病肾病(DN)，本研究评估灵芝多糖(GLPs)在抑制铁死亡，保护糖尿病诱导肾小管损伤的作用和机制。方法：调取GEO数据库数据，采用GSEA和加权基因共表达网络分析研究DN和铁死亡的关系。免疫浸润分析DN发病与炎症细胞和炎症因子之间的关系。高糖刺激的近端小管上皮细胞损伤和STZ诱导的糖尿病小鼠模型分别用于体外和体内实验。检测Nrf2表达、细胞活力、谷胱甘肽浓度和脂质过氧化，Elisa检测细胞IL-1的水平。结果：GLPs缓解高糖刺激的近端小管上皮细胞损伤，降低细胞MDA、ROS的水平，增加细胞表达Nrf2。GLPs的肾小管的保护作用能被Nrf2的抑制剂阻断。体内实验结果显示，GLPs能够降低小鼠血BNU、Cr，增加肾脏谷胱甘肽浓度。结论：GLPs能够通过增加Nrf2表达发挥抗氧化作用，抑制铁死亡，保护糖尿病所致的肾小管细胞死亡。

Abstract: Objective: Ferroptosis contributes to many kinds of acute and chronic renal injuries, including DN (diabetic nephropathy). This study evaluated the role and mechanism of Ganoderma lucidum poly-saccharides (GLPs) in inhibiting ferroptosis and protecting renal tubular injury induced by diabe-tes. Methods: Datasets from GEO cohort were collected, and relationship between DN and ferropto-sis was analyzed by GSEA analysis. Immune infiltration analysis was performed to investigate the relationship between DN pathogenesis and cytokines. High glucose-stimulated proximal tubular epithelial cell injury and diabetes mouse models were used in vitro and in vivo, respectively. GLPS was used to treat cells or mouse models. The expression of Nrf2, cell viability, glutathione concen-tration and lipid peroxidation, and the level of cellular inflammatory factors were detected. Results: GLPS could alleviate the injury of proximal tubular epithelial cells stimulated by high glucose, re-duce the level of intracellular MDA and ROS, and increase the expression of Nrf2 in cells. The pro-tective effect of GLPs on renal tubules can be blocked by the inhibitor of Nrf2. In vivo experiment results showed that GLPs could reduce the blood BNU and Cr, and increase the kidney glutathione concentration in mice. Conclusion: GLPs can play an antioxidant role by increasing the expression of Nrf2, inhibit ferroptosis, and protect renal tubular cell death caused by diabetes.

1. 引言

糖尿病肾病(Diabetes nephropathy, DN)是慢性肾病患者死亡和发病的主要原因之一，占慢性肾病患者的20%~30%，特征是细胞外基质蛋白沉积、肾小管间质纤维化、肾小球硬化 [1] 。目前已对DN的发生机制的有了深入的了解，多种细胞死亡参与了DN的发生，包括凋亡、焦亡和坏死 [2] 。

铁死亡是近期发现的一种非典型细胞死亡。低胱氨酸/谷氨酸反转运蛋白系统Xc-(xCT)和谷胱甘肽过氧化物酶4 (GPX4)水平降低细胞内胱氨酸浓度，减少谷胱甘肽合成和增加细胞内脂质过氧化物的积累，进而诱发细胞铁死亡 [3] [4] ，GPX4的诱导性缺失导致小鼠的急性肾功能衰竭和早期死亡 [5] 。研究表明，在急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)期间，铁死亡与肾小管细胞死亡有关 [6] 。铁抑制素-1 (Fer-1)是一种抑制铁死亡的小分子化合物，其可缓解AKI模型中的肾小管损伤 [7] 。尽管有研究已经发现铁死亡在DN患者肾小管损伤中发挥作用 [8] [9] 。然而，铁死亡在DN中的机制尚未阐明，如何有效阻止铁死亡，延缓DN的也研究较少。

作为人类健康护理的宝贵财富，中医药长期以来一直被利用于有效治疗DN。雷公藤及其制剂提取物已被证明对DN有效，可降低尿蛋白和降低血清肌酐 [10] [11] 。近来也发现多种中医药能够通过抑制铁死亡阻止DN进展，毛蕊异黄酮通过抑制铁死亡，在高糖诱导的肾小管损伤模型中的发挥保护作用 [12] 。灵芝多糖(Ganoderma lucidum polysaccharides, GLPs)是灵芝的基本生物活性成分之一，具有抗炎、抗氧化和抗凋亡的特性 [13] ，GLPs可以抑制MAPK和NF-κB途径显著减弱LPS诱导的TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症介质的释放 [14] 。本实验我们验证GLPs抑制铁死亡的作用，探讨GLPs保护DN的机制。

2. 材料与方法

2.1. 基因的表达数据采集与处理

本研究检索GEO数库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中糖尿病肾病样本数据，选择出包含DN患者基因表达数据GSE142153，其中有23例DN患者样本和10例正常样本的基因表达数据。采用Strawberry Perl (v5.30.0)对基因数据注释、调整，用R语言软件(Vesion4.2.2)中Limma包对数据校正后进行差异分析，以|log2FC| > 1和校正P < 0.05为统计学意义标准，使用ggplot2包用于建立DEGs的火山图，Pheatmap包构建表达差异基因(DEGs)的热图，通过韦恩图获取两个数推集的共同差异基因。使用clusterProfiler软件包对差异表达的基因进行GO (Gene Ontology)、KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)和GSEA (Gene Set Enrichment Analysis)富集分析。通过FerrDb数据库(http://www.zhounan.org/ferrdb/)筛选出经过验证的铁死亡相关基因(ferroptosis related gene, FRG)并进一步分析。使用WGCNA包对基因差表达数据进行WGCNA (weighted gene co-expression network analysis)富集分析。采用glmnet包进行LASSO (the least absolute shrinkage and selection operator)回归分析校正。采用pROC进行ROC (receiver operating characteristic curve)验证。采用reshape2、ggpubr、GSEABase、GSVA包进行免疫浸润分析。

2.2. 细胞培养

人近端管状上皮细胞HK-2购自ATCC (Manassas，VA，美国)，细胞培养在含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中，细胞培养在37℃、5%的CO₂条件下。对于糖尿病细胞模型，HK-2细胞培养在含有25 mM D-葡萄糖(Sigma，美国)的培养基中。然后，细胞分别用10和40 μM的GLPs (MedChemExpress，上海)处理。

2.3. MDA、GSH、BUN和Cr水平的测定

使用南京建成生物技术有限公司的试剂盒检测MDA、GSH、BUN和Cr，尿微量白蛋白试剂盒(Bethyl Laboratories，美国)，检测方法参照试剂供应商的说明书。

2.4. 乳酸脱氢酶的测定(LDH)

LDH测定试剂盒(K313；Biovision，美国)用于测量培养基中LDH的活性，用于评估细胞损伤。检测方法参照试剂供应商的说明书。

2.5. 细胞中脂质ROS的检测

使用C11-BODIPY试剂盒测量脂质ROS水平(Thermo Fisher Scientific，美国)。用10 mM C11-BODIPY培养处理的细胞1小时后，收获细胞并用含有1%牛血清白蛋白的PBS洗涤。脂质ROS水平为使用流式细胞仪(BD Biosciences，美国)。

2.6. 细胞活性检测

使用MTT检测细胞活力(Beyotime，上海)。共1 × 10³的HK-2细胞接种到96孔板的每个孔中。处理后，向孔中加入20 μL MTT并孵育4小时，吸弃孔内培养基，每孔加150 μL DMSO，振荡10分钟。用酶标仪(Bio-Rad Laboratories，美国)测定490 nm波长的吸光度。

2.7. 蛋白质印迹

向细胞中添加RIPA裂解缓冲液(Bio-Rad Laboratories，美国)。10%十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳上分离裂解液中的蛋白质，半干转膜法PVDF膜上进行印迹(Millipore Corp，美国)。用5% BSA封闭膜，使用ECL系统显影(BioRad Laboratories，美国)。抗体详细信息如下：抗GPX4 (Ab125066；Abcam，美国)；抗NCOA4 (Ab86707；Abcam，美国)；抗b-actin (proteinab，武汉)。

2.8. 动物实验

24只雄性C57BL/6J小鼠(6周龄)购自上海SLAC实验动物有限公司，动物实验经青岛大学动物伦理委员会批准。小鼠分笼饲养在清洁级(SPF)动物房内，SPF级动物房内环境温度为(25 ± 2)℃，相对湿度50%~70%，每天予以12 h光照。采用多次小剂量剂量(50 mg/kg STZ，连续注射4 d，联合高脂高糖饮食)诱导C57BL/6J小鼠糖尿病肾病模型。模型小鼠随机分为：对照组(注射等体积柠檬酸缓冲液)、10 mg/kg和40 mg/kg的GLPS治疗组。

2.9. 空腹血糖和OGTT

在小鼠禁食12 h后，鼠尾末端2 mm处剪断尾巴，将第一滴血弃去，第二滴血滴在血糖试纸上，检测空腹血糖。OGTT：对各组小鼠给予20%葡萄糖溶液2 g/kg进行灌胃，同样方法检测0、30、60、120 min血糖，绘制血糖–时间曲线，并计算曲线下面积(AUC)。

2.10. 肾功能及尿ACR测定

将采集的血液标本分离出血清后，采用全自动生化分析仪检测血肌酐、尿素氮等指标。采用ELISA法测定尿微量白蛋白及尿白蛋白。采用尿肌酐试剂盒(除蛋白法)测定尿肌酐水平，进而计算出尿ACR (尿微量白蛋白/肌酐)。

2.11. 苏木精伊红(HE)染色

肾组织取自不同组的小鼠并在4%多聚甲醛中浸泡24小时。然后冲洗，用梯度乙醇脱水，并切成切片。将苏木精添加到切片中5分钟，伊红染色1分钟。

2.12. 统计分析

所有数据均显示为平均值 ± 标准差(SD ± SEM)，数据采用one-way ANOVA方差分析或students-t检验，使用GraphPad Prism 5.0进行数据分析(GraphPad Software，美国)。

3. 结果

3.1. GEO数据库中差异表达基因功能富集分析

对DN患者与正常人外周血单个核细胞数据集(GSE142153)进行差异分析，将差异分析结果生成火山图(图1(A))，并将筛选出前100个差异基因生成热图(图1(B))。GO结果显示，差异基因富集在细胞因子介导的免疫应答、白细胞功能的调控(图1(C))。KEGG分析结果显示，差异基因富集在细胞因子和受体的相互作用、NOD 样受体信号通路(图1(D))。

(A) DN大鼠与正常大鼠肾脏差异基因热图，(B) DN大鼠与正常大鼠肾脏差异基因的火山图，(C) GO分析图，(D) KEGG分析图。

Figure 1. Functional enrichment analysis of differentially expressed genes in GEO database

图1. GEO数据库中差异表达基因功能富集分析

3.2. DN患者与正常人差异表达基因与FRG的相关

GSE142153差异分析的数据进行铁死亡基因集的GSEA富集分析，结果显示FRGs在DN大鼠表达显著上调(NES = 1.735, P < 0.001) (图2(A))。WGCNA富集分析结果显示，将所有基因分为4个模块，其中Meturquoise模块与DN关系最密切，呈正相关(r = 0.58，P < 0.001；图2(B))，按照|GS| > 0.5 & |MM| > 0.8条件进一步筛选出Meturquoise模块中与DN关系最密切的47个基因(图2(C))。将差异基因、Meturquoise模块与DN关系最密切基因、铁死亡基因集取交集，筛出5个交集基因(图2(D))。对筛出5个交集基因进行LASSO回归分析，筛出的IL-1B、SAMD 7和ALOX12 (图2(E)，图2(F))，将IL-1B、SAMD 7和ALOX12基因做ROC曲线分析，结果显示IL-1B、SAMD 7和ALOX12是预测DN的良好的指标(图2(G)~(I))。

3.3. GLPS抑制铁死亡发挥肾脏保护作用

为探讨GLPs在高糖所致肾小管损伤中的作用，HK-2细胞培养在含有25 mM葡萄糖培养基中。高糖组培养基中LDH水平高明显高于对照组(图3(A))，表明高糖治疗诱导了HK-2细胞的损伤；加入10和40 μM GLPs处理细胞，LDH水平降低(图3(A))。细胞活力实验证了实高糖导致肾小管损伤，而GLPs则缓解了损伤(图3(B))。为检测高糖致肾小管损伤中铁死亡的作用，我们测定了MDA、GSH和脂质ROS水平，结果显示高糖组细胞中MDA显著升高(图3(C))，GSH水平显著降低(图3(D))；荧光探针法显示，高糖组细胞中L-ROS水平升高(图3(E))。铁死亡抑制剂Fer-1能恢复高糖导致肾小管细胞MDA、GSH的变化(图3(C)、图3(D))，表明铁死亡在高糖诱导的肾小管上皮损伤中发挥重要作用。GLPs能显著恢复高糖导致肾小管细胞MDA，GSH的变化(图3(C)、图3(D))，降低高糖组细胞中L-ROS的荧光信号(图3(E))。表明GLPs可能通过阻止细胞铁死亡保护肾小管上皮细胞免受高糖的损伤。

(A) GSEA分析结果，(B) WGCNA富集分析结果，(C) DN关系最密切的47个基因，(D) 韦恩图，(E)~(F) LASSO回归分析结果，(G)~(I) ROC曲线分析分析结果。

Figure 2. Relationship between differentially expressed genes and FRG in DN patients

图2. DN患者差异表达基因与FRG的关系

(A) HK-2细胞中的LDH水平，(B) HK-2细胞中的活力，(C) HK-2细胞中的LDH水平，(D) HK-2细胞中的GSH水平，(E) 细胞中L-ROS水平。

Figure 3. GLPs inhibited ferroptosis and exerts a renal protective effect

图3. GLPs抑制铁死亡发挥肾脏保护作用

3.4. GLPS激活Nrf2抑制铁死亡

Nrf2蛋白在机体抗氧化应激损伤，维持细胞氧化还原内稳态发挥重要作用。本实验中，我们检测了高糖诱导的肾上皮细胞中Nrf2蛋白水平的下降(图4(A))，细胞核中Nrf2也升高(图4(B))，表明受高糖诱导的肾上皮细胞可能通过增加细胞Nrf2的水平和激活对抗损伤。采用GLPs治疗处理高糖损伤的肾上皮细胞，结果显示细胞中Nrf2蛋白水平的明显增加(图4(A))，细胞核中Nrf2明显升高(图4(B))。而Nrf2抑制剂(ML385；medchemexpress，上海)抑制了GLPs对受高糖诱导的肾上皮细胞的保护作用(图4(C))。

(A) Western blot检测HK-2细胞中Nrf2的表达，(B) 免疫荧光HK-2细胞核中的Nrf2水平，(C) MTT检测细胞活力。

Figure 4. GLPs inhibited ferroptosis via activating Nrf2

图4. GLPs激活Nrf2抑制铁死亡

3.5. GLPS抑制肾小管上皮细胞释放细胞因子

铁死亡是一种炎症性细胞死亡形式，胞内氧化还原失衡导致炎症介质的释放。通过对GSE142153数据进行单样本基因集富集分析(ssGSEA)，结果发现DN与多种炎性细胞激活相关，例如自然杀伤细胞、激活的B细胞、树突状细胞、巨噬细胞(图5(A)、图5(B))。将筛选的核心基因IL-1B、SAMD 7和ALOX12DN与免疫细胞进行相关性分析，结果显示IL-1β和SMAD7与免疫激活密切相关(图5(C))。本实验中，我们采用Ellisa监测了细胞培养液中IL-1的水平，高糖诱导的肾上皮细胞中IL-1的水平明显升高，GLPs治疗后，细胞中IL-1的水平下降(图5(D))。

(A) GSEA富集分析结果显示DN与铁死亡相关，(B)~(C) 免疫浸润分析，(D) Ellisa检测细胞培养液中IL-1的水平。

Figure 5. GLPs inhibited the release of cytokines from renal tubular epithelial cells

图5. GLPs抑制肾小管上皮细胞释放细胞因子

3.6. GLPs减轻糖尿病小鼠肾脏损伤

糖尿病小鼠血BUN、Cr水平明显高于正常组(图6(A)、图6(B))，为验证GLPs在体内的治疗作用，用10mg/kg和40 mg/kg的GLPs对STZ诱导的糖尿病小鼠进行了治疗。GLPs治疗的糖尿病肾病小鼠血BUN和Cr水平降低(图6(A)、图6(B))。与对照组小鼠相比，糖尿病肾病小鼠表现出较高的LDH、MDA水平，降低的GSH水平，GLPs降低了MDA水平，并增加了GSH水平(图6(C)、图6(D))。实验结束后，HE染色检测肾脏和胰岛的形态学变化。结果显示在糖尿病肾病小鼠中发现胰岛破坏，体积变小，内有较多炎性细胞浸润(图6(E))。肾小管上皮细胞肿胀，肾小球体积变小，血管袢减少，肾小球内过多蛋白沉积，GLPS则改善了肾小管扩张(图6(F))。此外，GLPS治疗明显降低了糖尿病小鼠肾脏中胶原沉积(图6(F))。

(A) 小鼠BUN的水平，(B) 小鼠肌酐水平，(C) 肾脏中MDA水平，(D) 肾脏中GSH水平，(E) 小鼠胰腺HE染色结果，(F) 小鼠肾脏HE染色结果。

Figure 6. GLPs alleviated kidney damage in diabetes mice

图6. GLPs减轻糖尿病小鼠肾脏损伤

4. 讨论

DN的严重微血管病变引起肾组织抗氧化能力的降低和ROS积累，导致RTEC损伤和组织破坏 [15] [16] 。DN患者的肾活检显示GPX4和SLC7A11降低 [9] ，db/db小鼠和链脲佐菌素处理小鼠的肾脏中总铁和FTH显著升高 [17] 。我们调取GEO数据库中的资料，将DN肾小管中的基因表达与铁死亡的相关基因做GSEA富集分析，结果显示DN肾小管中的基因表达与密切相关铁死亡。对DN肾小管中的差异基因做GO和KEGG分析，结果显示差异基因富集在氧化应激和脂质代谢通路 [18] 。

本实验中，我们采用高糖处理肾小管上皮HK-2细胞，细胞活力下降，细胞中MDA显著升高，GSH水平显著降低，细胞中L-ROS水平也升高。铁死亡阻滞剂Fer-1能恢复高糖导致肾小管细胞MDA，GSH的变化，降低高糖组细胞中L-ROS的。表明铁死亡在高糖诱导的肾小管上皮损伤中发挥重要作用。

有证据表明植物提取物已被证明对治疗DN有效，从蘑菇、真菌和植物中获得的多糖具有很强的清除自由基能力，可以防止生物体内的氧化损伤 [19] ，平菇是一种具有药理潜力的食用菌，其提取物中的杂多糖、β-葡聚糖、α-葡聚糖和低聚糖的混合物能对抗H₂O₂诱导的氧化损伤 [20] 。GLPS是灵芝的基本生物活性成分之一，具有抗炎、抗氧化和抗凋亡的特性 [21] [22] 。实验中，我们发现GLPS能显著降低高糖导致肾小管细胞MDA水平，增加GSH的含量，降低高糖组细胞中L-ROS的荧光信号，实验结果表明GLPS能缓解DN的氧化应激，减轻细胞损伤。

核因子红细胞2相关因子2 (Nrf2)在保护细胞免受ferroptosis中发挥核心作用 [23] [24] 。因此我们检测GLPS处理高糖导致肾小管细胞中Nrf2的表达，细胞中Nrf2和细胞核中Nrf2均明显升高。应用Nrf2的抑制剂能阻断GLPs对细胞的保护作用。本实验中，我们采用STZ药物制备糖尿病肾病小鼠模型，经GLPs治疗后，小鼠血液中BUN和Cr水平降低，肾小管上皮细胞中LDH和MDA水平下降，GSH水平升高。小鼠肾小管上皮细胞肿胀减轻，胶原沉积减少。表明GLPS可能通过阻止细胞铁死亡保护肾小管上皮细胞免受高糖的损伤。

研究发现，铁死亡细胞通过释放炎症相关的细胞因子从而激发细胞免疫，激活的免疫细胞通过识别不同模式的细胞死亡机制激发炎症反应，促进细胞死亡 [25] [26] 。通过比对糖肾肾小管上皮的单细胞基因测序分析，结果显示DN肾小管上皮的单细胞与免疫细胞的激活相关，其中IL-1可能起着重要作用。我们检测到DN肾小管细胞培养液中IL-1的水平升高，而GLPS则降低了细胞培养液中IL-1的水平。

总之，我们的研究发现GLPS能减轻高糖对肾脏造成的损伤，降低LDH和MDA水平下降的水平，增加细胞中Nrf2的表达对抗细胞氧化应激。同时，GLPs还能抑制受损肾小管上皮细胞释放细胞因子，缓解级联细胞免疫造成的细胞损伤。本实验为采用GLPs治疗DN提供了可靠的实验依据和机制。

基金项目

潍坊市自然科学基金，2021GX064。

NOTES

^*通讯作者。