基于CRISPR/Cas系统的即时诊断研究进展

Progress in Point-of-Care Diagnosis Based on CRISPR/Cas System

摘要: 面对突发公共卫生事件，快速、准确和便携的现场检测至关重要。基于CRISPR/Cas技术的分子诊断是目前现场检测主要方法，可以与多种信号传感方法相结合，集成到智能设备中，开发多个检测新平台。本文介绍基于CRISPR/Cas系统的传感器发展和现场应用，对CRISPR和现场检测的发展前景进行总结和展望。

Abstract: Fast, accurate and portable onsite testing is critical in the face of public health emergencies. Molecular diagnosis based on CRISPR/Cas technology is currently the main method of detection, which can be combined with a variety of signal sensing methods, integrated into smart devices, and develop multiple new detection platforms. This paper introduces the sensor development and field application based on CRISPR/Cas system, and summarizes and prospects the development prospect of CRISPR and field detection.

1. 引言

CRISPR-Cas系统作为原核生物获得性免疫系统，由成簇规则间隔的短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins, Cas)构成。因其识别和切割特定DNA或RNA序列，是目前分子诊断领域研究的热点。利用Cas蛋白(Cas12、Cas13、Cas14、Cas3等)结合信号放大和转化技术(荧光法、电位法、比色法、侧向流动技术等)，开发多种高灵敏度、高特异性、低成本的诊断平台，为检测提供新途径。

2. CRISPR/Ca系统概述

CRISPR/Cas核酸技术因具有高效的靶向性和可编程性，已经成为一种精准、高效、低价和高灵敏度的核酸检测方法 [1] [2] [3] 。CRISPR/Cas系统是细菌的一种适应性免疫系统，能够抵抗外源基因的入侵。CRISPR/Cas系统由CRISPR阵列和CRISPR相关蛋白组成。CRISPR阵列包含重复序列和空间序列，生成CRISPR RNA(CrRNA)。CrRNA与相应的Cas蛋白结合形成核糖核酸复合物(RNP)，作为基因组DNA编辑器 [4] 。CRISPR/Cas系统可以分为两类，I类CRISPR/Cas系统主要是由多个效应蛋白共同发挥作用；II类CRISPR/Cas系统广泛使用，只需要一种Cas蛋白(例如Cas9、Cas12a、Cas13a)就能发挥作用。Emmanuelle Charpentier和Jennifer A.Doudna研究小组阐明第二类CRISPR系统的DNA编辑机制，使其广泛应用 [5] [6] [7] 。随着学者对CRISPR/Cas生物学的全面认识，Cas12a和Cas13a反式剪切与单链DNA (SsDNA)或单链RNA(SsRNA)探针结合使用，成为分子诊断的研究新方法 [8] [9] 。Cas12a和Cas13a蛋白活化后，表现出反式切割活性，分别非特异性地切割单ssDNA和ssRNA，从而丰富检测的核酸种类(表1)。Cas蛋白具有强大的核酸结合能力和更广泛的切割能力，用于多种检测模式，包括荧光、电化学、电化学等。CRISPR/Cas系统由于其高效性、灵敏性、精准性的特点广泛应用于生物工程和分子诊断。

3. 基于CRISPR/CA检测传感器

3.1. 基于荧光信号检测的传感器

基于CRISPR的核酸检测通常分为四个步骤。首先，核酸提取与扩增；第二，等温放大；第三，根据不同的核酸类型选择CRISPR系统；最后，信号输出。Cas效应蛋白通过Cas12a或Cas13a识别目标序列后，剪切含有荧光团和猝灭剂的短ssDNA或ssRNA，产生荧光信号 [10] [11] 。根据这个原理开发特异性、高敏感性酶报告和DNA内切酶靶向CRISPR反转录报告基因 [12] 。基于荧光信号的CRISPR诊断与等温扩增技术结合系统在公共卫生事件方面具有很大优势，可以在等温条件下快速检测感染性疾病，用于可视化检测。同时，避免致病性核酸的气凝胶污染，降低检测成本(如图1(A)) [13] [14] [15] 。

更好地现场应用CRISPR/Cas诊断技术，学者将侧流检测技术与CRISPR/Cas系统相结合，建立更为方便的检测平台 [16] 。羧基荧光素(FAM)–生物素报告器是基于侧向流动分析法的CRISPR/Cas12a检测分析方法。第一条控制线捕获未降解的细胞，而第二条测试线检测Cas12反切活性的信号 [16] 。在靶标存在的情况下，Cas12a剪切生物素化ssDNA报告基因，无法连接到已经固定DNA探针，使其在测试线上不可见(图1(B))。基因组释放、等温扩增和CRISPR/Cas检测相结合，可以相对较快地完成病原体核酸检测。LED灯激发CRISPR/Cas裂解的荧光分子，从而实现检测信号的可视化。这种检测模式运用于多种病原体的检测，如SARS-CoV-2、疟原虫、非洲猪瘟病毒等 [17] [18] [19] 。

Table 1. An overview of key features of CRISPR system

表1. CRISPR系统的关键特征

(A) 基于CRISPR/Cas系统荧光检测示意图 (B) 基于CRISPR/Cas系统侧向流动分析法测示意图。

Figure 1. Detects fluorescent sensors based on the CRISPR/Cas system

图1. 基于CRISPR/Cas系统检测荧光传感器

3.2. 基于比色分析法的传感器

3.2.1. 侧向流动分析法

比色分析法具有结果易判读、使用便捷、成本低等优点，在分子检测领域是常用的方法。侧向流动分析法(lateral flow assay, LFA)又称为免疫层析分析法，是一种用于检测液体中是否存在目标物质的便捷检测装置。CRISPR/Cas系统与侧向流动分析法相结合，开发出新的检测平台(图2(A))。试纸的样品垫、控制线(C线)和测试线(T线)分别用抗FAM抗体、生物素配体和抗兔抗体进行预处理。当CRISPR/Cas系统激活时，T线切割捕获，显示阳性结果，C线捕获时，结果显示为阴性 [20] 。这一方法已经运用于铜绿假单胞菌、斑疹细螺旋体、非洲猪瘟病毒检测 [21] [22] [23] 。这种方法的缺点是难以量化，优点是快速检测和高灵敏度。基于Cas9的侧向流动分析法，通过等温扩增后，目标序列经生物素修饰的引物导入，同时与亲和素修饰T线结合。另一种基于Cas9的侧向流动分析法在等温处理过程中使用具有特定修饰的化学引物，向目标序列引入特殊的化学基团(地高辛、生物素和异硫氰酸荧光素异构体)。Cas9nAR选择等温扩增位点，化学修饰的引物将特定的基团引入扩增子，这些基团可以由T-线捕获，从而检测出结果。

3.2.2. 金纳米粒

金纳米粒子溶液由于其电磁特性，在粒子聚集后由红色变为紫色。通过巯基修饰金纳米颗粒表面的ssDNA或ssRNA，防止纳米粒子的聚集。用Cas12a/13a对ssDNA或ssRNA进行反式切割后，金纳米颗粒聚集在一起，溶液颜色的变化可作为检测(图2(B)) [24] [25] 。采用该方法，可以检测出SARS-CoV-2 [26] 。纳米酶是常用的一种纳米探针。纳米酶作为可视化CRISPR为基础的检测方法。基于纳米酶的免疫吸实验附结合CRISPR/Cas13a系统，可以通过纳米酶的催化反应，放大检测信号，提高灵敏度，实现无扩增RNA检测 [27] 。比色传感器使CRISPR诊断具有高灵敏性、高效性的特点，使其广泛应用与分析检测，如表2所示。

(A) 基于CRISPR/Cas系统侧向流动分析法检测示意图 (B) 基于CRISPR/Cas系统金纳米颗粒子检测示意图。

Figure 2. A colorimetric sensor based on the CRISPR/dCas9 system

图2. 基于CRISPR/dCas9系统的比色传感器

Table 2. An overview of the performance of CRISPR detection based on colorimetric signal sensing

表2. 基于比色信号传感的CRISPR检测性能

3.3. 基于电子系统的传感器

3.3.1. 电信号

基于等温扩增的CRISPR/Cas技术具有高灵敏度特点，常用于扩增核酸分子。但是，等温扩增试剂的成本较高，提高CRISPR/Cas检测的成本。学者开发电信号传感作为CRISPR/Cas检测的新平台。基于电信号的CRISPR/Cas检测平台通常使用有dCas9蛋白，这种蛋白只能结合而不能切割靶核酸分子。Hajian等人将CRISPR/dCas9固定在石墨烯场效应晶体管上，当识别并结合目标核酸分子，电导率发生变化，从而检测出结果 [28] 。带电DNA分子可以由固定在石墨烯上捕获dCas9，降低系统的电阻，产生电流响应。使用时，滴1滴样品到仪器上；将其放置，同时进行孵育、清洗，最终通过两个铂电极评估平台的导电性，完成样品检测。该方法在无扩增的情况下检出限为15 fM，检测时间约为15 min。

纳米孔传感器基于CRISPR/dcas9技术进行电信号传感，其原理是dCas9与DNA结合，通过纳米孔时的孔隙的离子电流下降，电信号发生变化 [29] 。dCas9不同结合位点的纳米孔信号(离子电流)可以分解，这能用于不同样品同时检测。设计不同的crRNA来区分DNA不同序列，这些crRNA可以结合到同一DNA的不同位点(图3(A)) [30] 。这种方法在DNA混合物中区分不同DNA序列，证明该方法的特异性。若含有较少的DNA，目标DNA链通过纳米孔的概率降低，那么需要更长的测量时间。为了解决这个问题，开发基于Cas12a反式切割的纳米孔传感器，Cas12a反式切割可降解纳米孔的DNA探针，使DNA探针的电信号发生明显变化，用于检测。基于Cas12的纳米孔传感技术可以放大检测信号，利用其反式切割活性实现对HIV-1和SARS-CoV-2的快速敏感检测(图3(B)) [31] 。

(A) 基于CRISPR/dCas9系统纳米孔检测示意图 (B) 基于CRISPR/Cas12a纳米孔检测示意图。

Figure 3. Based on the CRISPR/Cas system electrical sensor

图3. 基于CRISPR/Cas系统电传感器

3.3.2. 电化学信号

亚甲基蓝是一种经典的电化学标记。通过巯基将ssDNA-亚甲基蓝固定在金电极表面，在目标序列激活CRISPR/Cas12a后反式切割ssDNA释放亚甲基蓝，随着亚甲基蓝的释放电流峰值而减小 [32] 。使用ssDNA 将亚甲基蓝标签定位在靠近电极表面的位置，从而产生初始电流峰值，结合CRISPR/ Cas12检测，电流峰值变化更为显著(图4(A)) [33] 。

使用氧化酶放大电信号是一种常用的方法。Bruch等人用ssRNA将葡萄糖氧化酶固定在电极表面，经靶序列激活后，Cas13a切割ssRNA，释放葡萄糖氧化酶(图4(B))。葡萄糖氧化酶能把溶液中氧化葡萄糖水解，产生D-葡萄糖-内酯和H₂O₂，电流发生变化用于检测。如果存在靶RNA，则电流信号将低于空白 [34] 。不使用电化学标记，改用电用化学阻抗谱作为检测信号，可以提高电化学CRISPR的诊断灵敏度。用ssDNA修饰电极表面，在CRISPR/Cas12a系统识别目标序列后进行降解，并将电极的电化学阻抗谱跃迁作为检测信号 [35] 。基于CRISPR/Cas的电化学检测技术已经实现了对人乳头瘤病毒16型(HPV-16)、人体免疫缺陷病毒(HIV)、细小病毒B19 (PB-19)和单核细胞增生李斯特氏菌等病原体的高度敏感检测 [36] [37] 。表3概述了基于电化学传感的CRISPR检测方法的性能，具有较高的灵敏度，不需要核酸扩增即可检测。

Figure 4. Electrical sensor based on the CRISPR/Cas system

图4. 基于CRISPR/Cas系统的电传感器

Table 3. An overview of performance of CRISPR detection based on electrochemical signal sensing

表3. 基于电化学信号传感的CRISPR检测性能概述

4. 基于CRISPR/CA系统检测新平台

4.1. 芯片检测平台

微流控芯片具有集成、高通量、便携、轻巧等优点，使得基于微流控芯片的及时检测广泛应用。在微流控芯片上，通过旋转阀控制流体流动，依次进行核酸提取、扩增和CRISPR检测，可实现快速(小于50分钟)检测病原菌核酸。副溶血性弧菌核酸检测应用基于CRISPR微流控芯片原理(图5(A)) [38] [39] 。吴等人设计了一种用注射器和磁珠推拉的片上核酸提取方法，使用简单，成本低 [40] 。在流体芯片上，所有的测试部件都是预先保存，用旋转阀和注射器精确地控制液体的流动以及混合。在80 min内，可完成DNA提取、等温扩增和CRISPR分析。此外，基于微流控装置的全封闭核酸检测，能避免操作人员感染病原体，又能避免核酸气溶胶的污染，为其应用提供市场。Nguyen等人开发一种基于CRISPR传感器用于SARS-CoV-2检测试纸，该传感器可以嵌入掩膜中，使用更为方便 [41] 。CRISPR诊断所需的每个模块都放置在面具的外部或内部。为了收集病毒，放置收集垫于口罩内侧。CRISPR诊断所需的全套冻干试剂包含在µPAD中，这是一种基于微流控纸的分析设备，可以接收从样本收集垫收集到的病毒颗粒。

使用基于CRISPR的微流控技术诊断分析很难检测到多个目标序列，而高通量微流控技术可以实现多种检测。多路复用芯片通过离心分成几个独立的检测区，检测结果不会相互干扰 [42] 。同样，纸基微流控芯片设计成多个独立的检测模块，针对不同靶点的CRISPR试剂在不同区域进行冻干处理，实现样品溶液层析至检测区域完成诊断 [43] 。基于纸质的CRISPR微流控诊断技术是一种成本较低的方法，可以广泛推广。此外，为了提高检测量，Ackerman等开发基于CRISPR/Cas13a诊断系统和微流体的组合阵列反应，可以检测26种呼吸道相关病毒，例如SARS-CoV-2等冠状病毒和多种流感病毒(图5(B)) [44] 。

(A) 基于CRISPR/Cas 系统的微流控芯检测器 (B) 基于CRISPR/Cas系统的多重微流体平台检测器。

Figure 5. Chip diagnostic device based on CRISPR/Cas system

图5. 基于CRISPR/Cas系统的芯片诊断器

4.2. 智能手机检测平台

大多数应用 CRISPR技术的方法依赖于荧光信号，智能手机检测器是检测荧光信号的常用设备，其可以检测精准度可以到达1%。智能手机结合CRISPR 诊断是及时检测的热点。这种方法在使用中需要完全关闭检测系统，避免核酸气溶胶污染，同时保持与临床检测结果相同的阳性率和阴性率 [45] 。为了确定检测结果准确性，使用二元分类模型定制软件对获取的荧光图像进行量化分析 [46] 。与服务器共享数据，实时跟踪数据，及时反馈检测信息。Fozouni 等人将荧光信号转换为病毒载量，用于核酸检测的定量分析(图6) [47] 。这种方法不需要扩增核酸检测，单个目标RNA可以激活多个Cas13a RNP，利用多个RNPs识别相同病毒RNA的不同部分，增加活性酶的浓度，加快检测速度。

Figure 6. A smartphone detector based on the CRISPR/Cas system

图6. 基于CRISPR/Cas系统的智能手机检测器

4.3. DNA辅助检测平台

CRISPR/Cas系统只能检测DNA或RNA的特点限制在非核酸诊断中的应用。DNA具有广泛的目标识别能力，因此可以扩展CRISPR-Cas系统对许多其他目标的使用，为生物分析和生物医学研究打开一个新的方向。利用DNA将非核酸转化为核酸信号，以充分利用CRISPR/Cas系统。这种模式是通过DNA裂解，激活CRISPR/Cas12a，引起荧光探针的反式切割。荧光探针作为检测信号(图7) [48] 。该系统由与Cas12a RNP匹配的fDNA分子、ssDNA报告基因(ssDNA-fq)和Cas12a RNP组成。fDNA处于没有目标分析物的锁定状态，阻止Cas12a启动反式剪切。当目标分析物与fDNA相互作用时，Cas12a反式剪切活性激活，导致ssDNA-FQ降解，产生荧光信号 [49] 。该方法可在室温下检测ATP和钠离子，检出限分别为4.75 μM和0.10 mM。运用此方法将CRISPR/Cas诊断的检测对象扩展到病原体、细胞、外泌体、金属离子、小分子化合物等，加速CRISPR/Cas及时检测的发展 [50] [51] [52] 。表4总结DNA辅助非核酸靶标检测的CRISPR方法应用。

Figure 7. DNA-assisted detector based on the CRISPR/Cas system

图7. 基于CRISPR/Cas系统的DNA辅助检测器

Table 4. An overview of functional DNA-assisted CRISPR methods for different non-nucleic acid target detection

表4. 功能性DNA辅助CRISPR方法检测不同非核酸

5. 小结与展望

CRISPR/Cas系统因其精准定位和切割功能，成为分子检测平台中重要的组成部分。CRISPR/Cas检测可以与荧光信号、比色分析法、电子读出系统、芯片、智能手机等传感器方法，开发多个新的检测平台并广泛应用于及时检测。在定性和定量分析方面，基于CRISPR/Cas的及时检测具有巨大的潜力和多功能性，其可定制和灵活的特性为检测急性感染性疾病提供了可行的应急策略。CRISPR/Cas系统的检测平台具有快速、便携、高效、准确、低成本等特点，可以实现对多种病原体和非核酸分子检测分析。尽管基于CRISPR/Cas系统的及时检测平台已经取得突破性进展，但要将尖端技术转化为可用的应用程序还需要进一步研究。目前仍然存在许多问题：(1) CRISPR/Cas系统检测平台容易受到气溶胶污染，导致假阳性结果；(2) 需要等温扩增扩大靶标，增加检测操作的复杂性；(3) CRISPR/Cas系统缺乏标准化的程序；(4) 目前CRISPR/Cas系统检测平台没有办法实现多组分同时检测，多样本同时检测；(5) 由于CRISPR系统的可扩展性，在检测系统中加入多种信号传感技术，这些技术可以与商业平台兼容，有希望实现过程自动化和标准化等。这些问题仍需努力解决，在今后的工作可能需要更多地关注于便捷性、标准性、高效性和及时性，以便应用和推广。

基金项目

衡阳市科技创新计划项目(202121034379)；衡阳市科技计划项目(202010031493)；衡阳市科技指导性项目(S2018F9031018292)；湖南省教育厅科学研究项目(21B0874)；湖南环境生物职业技术学院培优计划科研专项项目(PY2021-09)；湖南环境生物职业技术学院青年基金项目(ZK2021-03)；衡阳市科技计划项目(202121034369)。

NOTES

^*通讯作者。