MTDH与骨肉瘤的相关研究进展

Research Progress in Correlation between MTDH and Osteosarcoma

摘要: 骨肉瘤是青少年常见的原发性恶性肿瘤，以恶性程度高、预后差、5年生存率低为特点，对患者的生命健康造成严重威胁。如何有效改善骨肉瘤患者的预后，提高治愈率，已成为目前骨肉瘤治疗研究中的热点问题。在许多恶性肿瘤的研究中，异黏蛋白(MTDH)已被证实在肿瘤的发生发展中具有重要作用，参与肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移及耐药过程。在骨肉瘤中MTDH基因的作用也得到了部分验证，可将其作为骨肉瘤治疗中的新靶点。本文主要综述了MTDH基因的最新研究现状及其在骨肉瘤中的作用的研究进展。

Abstract: Osteosarcoma is a common primary malignant tumor in adolescents, characterized by high malig-nancy, poor prognosis, and low 5-year survival rate, posing a serious threat to the life and health of patients. How to effectively improve the prognosis of patients with osteosarcoma and increase the cure rate has become a hot topic in current research on the treatment of osteosarcoma. In many studies of malignant tumors, it has been proven that metadherin (MTDH) plays an important role in the occurrence and development of tumors, participating in the proliferation, invasion, metastasis, and drug resistance processes of tumor cells. The role of MTDH gene in osteosarcoma has also been partially validated, and it can be used as a new target in the treatment of osteosarcoma. This article mainly reviews the latest research status of MTDH gene and its role in osteosarcoma.

1. 引言

异黏蛋白(metadherin, MTDH)基因，也被称为星形胶质细胞升高基因-1 (AEG-1)或LYRIC (Lysine Rich CEACAM1)，是近年来发现的一个癌基因，被认为是肿瘤相关抗原 [1] 。其高表达于多种恶性肿瘤如乳腺癌、肝癌、骨肉瘤黑色素瘤、胶质瘤、神经母细胞瘤、前列腺癌和食道癌，参与并调节增殖、迁移、侵袭、血管生成、化疗耐药性、转移等多种肿瘤生物学过程 [2] 。因此，MTDH基因可能可作为肿瘤治疗的新靶点，对未来恶性肿瘤的靶向治疗具有重要价值。本文主要综述了MTDH基因的最新研究动态及其在骨肉瘤治疗方面的研究进展。

2. MTDH基因简介

2.1. MTDH基因的生物学特征

MTDH基因于2002年作为人类免疫缺陷病毒-1 (human immunodeficiency virus-1, HIV-1)和肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)诱导基因首次在人类初级胎儿星形胶质细胞中被克隆。随后，Brown和Ruoslahti通过体内噬菌体筛选，将小鼠基因克隆为介导乳腺癌细胞向肺转移的蛋白，并命名为MTDH [2] 。MTDH基因全长cDNA包含3611个碱基，不包含poly-A尾，由12个外显子和11个内含子组成，位于8q22位点 [3] 。MTDH编码一种由582个氨基酸组成，分子量为64kD的Ib型单通道跨膜蛋白，主要表达于内质网和核周间隙 [4] [5] 。MTDH/AEG-1作为跨膜蛋白出现在细胞质、内质网、核膜和核仁中。该蛋白在哺乳动物中高度保守，在大多数脊椎动物中都能找到，但在非脊椎动物中没有 [5] 。MTDH具有3个核定位信号区(nuclear localization signals, NLS)，分别位于氨基酸79~91、432~451、561~580之间，为lysine聚集区域，其中NLS1和NLS3序列能够介导MTSH的细胞核内定位和核转位，发挥调节转录作用，NLS-2调节并诱导在胞质中的泛素化修饰 [6] [7] 。

2.2. MTDH的作用途径

MTDH被认为是磷脂酰肌醇3-羟激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase, PI3K)/蛋白激酶B (protein kinase B，PKB，又称AKT)、核因子-κB (nuclear factor-κB, NF-κB)、Wnt/β-catenin、促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)等信号通路的汇聚点，在炎症、血管生成、缺氧、EMT、自噬活性和化疗耐药中发挥重要作用 [8] 。

2.2.1. PI3K/AKT通路

原癌基因Ha-ras可以激活PI3K形成PIP3使PI3K/Akt信号通路被激活的过程是癌细胞主要生存途径之一 [8] [9] 。研究表明，MTDH基因的过表达可激活PI3K/Akt信号通路，Akt被活化后从细胞膜转移至细胞质及细胞核，通过调控mTOR、磷酸化和失活糖原合酶激酶3β (GSK3β)、抑制叉头盒O1 (forkhead box O1, FOXO1)等途径影响骨肉瘤细胞的增殖及凋亡 [10] [11] 。因此，MTDH基因与PI3K/AKT通路之间高度相关，可作为骨肉瘤治疗的重要靶点。

2.2.2. NF-κB通路

NF-κB通路是由IκBs组成的经典肿瘤相关调控信号通路。NF-κB转录因子可在多种肿瘤细胞中表达，当MTDH过表达时，IκBs泛素化降解并释放p50和p65复合物，这些复合物随后被转运到细胞核中与转移到细胞核中的MTDH相互作用，激活基质金属蛋白酶1 (matrix metalloproteinase 1, MMP1)表达，调控细胞增殖、凋亡、炎性反应及免疫反应等过程 [1] 。Zhang等的研究发现锌指转录因子Miz1抑制MTDH表达后阻止了NF-κB通路的激活 [12] 。Wang等的研究发现MTDH基因可通过NF-κB通路诱导含表皮生长因子的纤维蛋白样细胞外基质蛋白1 (epidermal growth factor-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1, EFEMP1)调控基质金属蛋白酶2 (matrix metalloproteinase 2, MMP-2)的表达，介导骨肉瘤细胞的迁移和侵袭 [13] 。

2.2.3. Wnt/β-catenin通路

Wnt/β-catenin通路也是参与MTDH基因介导的肿瘤进展的重要信号通路之一 [14] - [20] 。Wnts是一种分泌糖蛋白，在多种细胞过程、胚胎发生、体轴形成、神经发生和癌变中起着关键作用。β-Catenin是典型Wnt信号通路的主要下游效应物。β-catenin通过酪蛋白激酶Iα和糖原合酶激酶3β (GSK3β)的作用在丝氨酸和苏氨酸残基上磷酸化降解，驱动β-catenin核易位，激活Wnt通路 [14] 。在Li等人的研究中，证实了抑制MTDH基因的表达可抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活，调控结直肠癌细胞的增殖及侵袭 [15] 。多项研究表明，通过抑制Wnt/β-catenin通路的激活，可抑制骨肉瘤细胞的增殖、转移及侵袭等恶行生物学行为 [16] [17] [18] [19] [20] 。

2.2.4. MAPK通路

MTDH基因也可通过激活MAPK通路影响肿瘤的发展。丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是丝氨酸–苏氨酸蛋白激酶，由生长因子调控的细胞外信号相关激酶(ERKs)、应激激活的MAPKs、c-jun nh2-末端激酶(JNKs)和p38 MAPKs组成，是由MAPK、MAPK激酶(MAP2K)和MAPK激酶(MAP3K)组成的三激酶信号模块的一部分 [21] 。在Xu等人的研究中miR-494高表达可使p38 MAPK信号通路失活，促进细胞凋亡，抑制髓母细胞瘤细胞的侵袭、迁移和增殖 [22] 。Zhu等人的研究表明，MTDH基因被敲低后可抑制p38 MAPK通路的激活，介导上皮–间充质转化抑制膀胱上皮细胞的纤维化 [23] 。

3. 骨肉瘤简介

3.1. 骨肉瘤的病因、流行病学及诊断

骨肉瘤是最常见的骨原发性恶性肿瘤，起源于间叶组织，其发病率呈双峰分布，在青少年和大于60岁的成年人发病率最高，且在男性中较为常见 [24] 。病理类型80%为传统型，其中包括骨母细胞型、软骨母细胞性及纤维母细胞型三种常见亚型。骨肉瘤的好发于四肢长骨干骺端，常见的发病部位依次是股骨、胫骨、肱骨，好发于10~20岁青少年 [25] 。骨肉瘤的病因仍未明确，目前认为其发病是多种因素造成的，主要包括基因因素和环境因素。Li-Fraumeni综合征、遗传性视网膜母细胞瘤和Diamond-Blackfan贫血以及涉及RECQ基因家族的原发性DNA解旋酶疾病，包括Rothmund-Thomson综合征、RAPADILINO综合征、Bloom综合征和Werner综合征等癌症易感综合征被认为是骨肉瘤发生的风险因素 [24] 。在老年人群中，Paget病是一种相当常见的代谢性骨病，约1%的佩吉特病患者会进展成骨肉瘤 [26] 。除此之外，曾经接受过放疗或化疗也与儿童骨肉瘤的发生率增加相关 [27] 。乳糖脱氢酶(LDH)、碱性磷酸酶(ALP)、特异性AT序列结合蛋白2 (Special AT-rich sequence-binding protein 2, SATB 2)以及骨钙素等均为骨肉瘤的敏感标志物，其中碱性磷酸酶在骨肉瘤中具有最重要的诊断意义。使用X线、磁共振成像(MRI)、计算机断层扫描(CT)、正电子发射断层扫描(PET)或这些方法的组合也可以辅助诊断骨肉瘤。近些年骨闪烁扫描(BS)经常与CT联合使用以识别转移 [28] 。通过微创穿刺活检方法或开放活检对骨组织活检样本进行病理评估以确定骨肉瘤的分型及分期在骨肉瘤的诊断中也是极为重要的 [24] 。

3.2. 骨肉瘤的相关调控

骨肉瘤的发生及发展受多种分子生物学机制及其下游信号通路的调控。DNA的突变、非编码RNA的表达改变及表观遗传学的变化通常认为是骨肉瘤发生发展的重要影响因素。

目前普遍认为TP53及RB1基因的突变在骨肉瘤中是最常见的基因改变。由TP53基因编码的p53蛋白可调控细胞生长周期、DNA复制和细胞分裂及激活细胞凋亡等细胞过程 [29] 。p53细胞蛋白在正常情况下作为成骨细胞形成的负调控因子，可抑制一些在成骨祖细胞的初始成骨阶段所必需的装炉因子，如Runx2等。当TP53基因突变时可导致p53蛋白失活，使细胞生长失控，驱动肿瘤的发展 [30] 。RB1基因为视网膜母细胞肿瘤的抑制基因，现已被确定为骨肉瘤发展的驱动因素之一，有研究表明RB1基因对于机体的成骨分化、骨重塑及祖细胞增殖分化的稳定性具有重要意义。Walkley等发现小鼠成骨细胞中靶向p53和Rb的突变足以诱导具有人类疾病特征的转移性骨肉瘤 [31] 。

除此之外，c-Myc基因在OS发病机制中也具有重要作用。c-Myc基因在10%以上的病例中过表达，c-Myc基因涉及细胞增殖、分化和细胞凋亡等细胞生理过程。c-Myc基因过表达可刺激细胞外信号调节激酶–丝裂原活化蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase-mitogen-activated protein kinase, MEK-ERK)通路的激活，通过抑制PI3K-AKT通路的活性增强骨肉瘤细胞的侵袭能力 [32] 。

非编码RNA在骨肉瘤的生物学过程中也发挥着重要的调节功能。MicroRNAs (miRNAs)是一类内源性的非编码小RNA，在分化、细胞增殖、细胞周期控制、凋亡等多种生物过程中具有重要的调节作用。Meng 等研究证明miRNA-22通过下调PI3K、AKT及雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycin kinase, MTOR)的表达，抑制自噬和诱导骨肉瘤细胞及耐药细胞凋亡 [33] 。环状RNA (Circular RNAs, circRNAs)，可以充当miRNA海绵调节转录或转录后基因表达，并参与多种重要的生物过程的调控。WU等人研究结果表明circTADA2A通过海绵结合miR-203a-3p上调环AMP反应元件结合蛋白3 (Cyclic AMP-responsive element-binding protein 3, CREB3)的表达，显著增强了骨肉瘤细胞的增殖、侵袭及肿瘤在体内的生长和转移 [34] 。

DNA甲基化、组蛋白修饰以及核小体重塑等表观遗传修饰的改变也可导致骨肉瘤的发生和进展 [30] 。

4. MTDH基因与骨肉瘤的恶性生物学行为

MTDH基因在骨肉瘤的发生及发展中具有重要意义，与骨肉瘤的多种恶性生物学行为有关。多位学者证实了MTDH基因在骨肉瘤中高表达，且存在转移的骨肉瘤组织中MTDH基因的表达水平高于无转移的组织 [35] [36] 。

4.1. MTDH基因与骨肉瘤的增殖、侵袭与转移

MTDH基因能够参与及调节骨肉瘤细胞的增殖、侵袭及转移过程。通过MTT试验及Transwell试验，可观察到过表达MTDH基因可明显增强骨肉瘤细胞的增殖及侵袭能力。

有研究表明，MTDH过表达可介导骨肉瘤的增殖、侵袭过程与基质金属蛋白酶-2 (matrix metalloproteinase-2, MMP-2)相关，通过转染MTDH si-RNA可抑制MMP-2的表达，降低骨肉瘤细胞的侵袭性 [37] 。此外，Wang等人通过对含表皮生长因子的纤维蛋白样细胞外基质蛋白1 (epidermal growth factor-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1, EFEMP1)的研究发现，MTDH可通过诱导EFEMP1的表达，间接调控MMP-2的表达，对骨肉瘤的增殖、侵袭及转移等产生影响。因此，可认为MTDH至少部分通过调节MMP-2对骨肉瘤的增殖侵袭等进行调控 [13] 。

MTDH也可通过受microRNA的表达调控骨肉瘤的增殖与侵袭。Guo等通过检测microRNA-136对骨肉瘤增殖侵袭及转移的影响，并验证MTDH与microRNA-136间的靶向关系后，证明miR-136可能通过负向调控其靶基因MTDH抑制OS细胞的增殖、迁移和侵袭 [38] 。大量其他类似研究也证明了miR-22、miR-342-3p、miR-448等也可通过调控MTDH的表达抑制骨肉瘤细胞的增殖及侵袭。因此，MTDH基因在骨肉瘤的增殖侵袭及庄毅中发挥重要作用，可以此作为骨肉瘤治疗的重要靶点。

4.2. MTDH基因与新生血管的生成

肿瘤新生血管的生成是维持肿瘤发生发展的重要条件。由血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)、血管生成素(angiopoietin, ANG)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)等促血管生成因子和血小板应答蛋白1、血小板因子4、血管抑制素和内皮抑制素等血管生成抑制剂相互作用，共同调控血管生成过程 [39] 。在免疫组化分析中，从裸鼠获得的肿瘤注射了克隆的大鼠胚胎成纤维细胞AEG-1克隆，结果表明肿瘤具有增加微血管密度和血管生成标志物水平的作用。MTDH基因可通过调控NF-κB、PI3K/AKT通路诱导肿瘤新生血管生成。一项关于三阴乳腺癌标本的分析结果可见MTDH与VEGF水平与微血管密度(microvessel density, MVD)密切相关，当MTDH过表达时，VEGF水平及MCD均增高 [40] 。在小细胞肺癌、肝细胞癌、头颈部鳞状细胞癌、宫颈癌等多种恶性肿瘤中，MTDH受miRNA的调控，介导肿瘤的新生血管生成 [41] [42] [43] [44] 。Zhang等人通过对miRNA的研究发现miRNA可通过靶向VEGFA/VEGFR1途径，抑制骨肉瘤的血管生成 [45] 。根据上述研究，MTDH基因可受miRNA的调控，调控VEGF、MMP等血管生成因子的表达水平，对骨肉瘤中新生血管的生成过程具有极其重要的影响。

4.3. MTDH基因与上皮–间充质转化

上皮–间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)是一种可逆的细胞过程，指在某些特定条件下，上皮细胞可短暂地处于准间充质细胞状态，呈现梭形、间充质形态，并可恢复到上皮细胞状态的过程，可使上皮细胞拥有间质细胞的特性 [46] 。在这一过程中，上皮细胞顶–基底极性等上皮细胞的特征，而获得了前后极性等间质细胞特征，这使上皮细胞获得迁移及侵袭的能力。因此在骨肉瘤等恶性肿瘤中，EMT可能是肿瘤细胞发生侵袭及转移的重要途径之一 [47] 。骨肉瘤起源于间叶组织，其细胞表型由EMT诱导转录因子(EMT-inducing transcriptions factor, EMT-TF)的功能维持，如TWIST1、SNAIL、SLUG、ZEB1和ZEB2。有研究表明，EMT-TF在骨肉瘤细胞中过表达时，可促进上皮–间充质转化，促进骨肉瘤细胞的侵袭和转移 [48] [49] 。在许多恶性肿瘤中，MTDH通过激活NF-κB、Wnt/β-catenin、MAPK等信号通路，调控EMT过程，促进肿瘤细胞的转移 [23] [50] [51] 。TANG等在验证了在有转移骨肉瘤组织中MTDH基因过表达后，通过慢病毒转染敲除骨肉瘤细胞的MTDH基因，使用免疫印迹法检测EMT及ERK信号通路标记物，最终结果显示MTDH通过EMT促进骨肉瘤细胞的转移。类似的结果在非小细胞肺癌、肝癌、头颈部鳞状细胞癌中也得到验证 [52] [53] [54] 。

4.4. MTDH基因与骨肉瘤的耐药

化疗药物的耐药性是导致骨肉瘤治疗失败或发生复发的重要原因之一。MTDH基因在骨肉瘤的广谱化疗耐药性中也具有重要作用。在对NCI-60细胞系的药物基因组分析中，发现MTDH基因的表达与化疗药物的耐药有显著的相关性 [55] 。当MTDH基因过表达时，化疗敏感性受影响的药物包括5-氟尿嘧啶、阿霉素、紫杉醇、顺铂等以及靶向治疗。MTDH基因通过抑制细胞凋亡、保护性细胞自噬、NF-κB等信号通路影响肿瘤的化疗敏感性。Zhang等通过检测转染MTDH表达质粒及沉默MTDH基因质粒的Hela细胞中自噬及凋亡相关蛋白，发现当MTDH基因过表达时，可激活Erk/NF-κB通路，诱导Hela细胞发生自噬，抑制细胞凋亡 [56] 。在胃癌细胞系中，MTDH基因过表达时P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)的表达，增强5-FU的耐药性 [57] 。miRNA可通过调控MTDH基因的表达对肿瘤的耐药性产生影响。LI等使用5-氟尿嘧啶及顺铂两种化疗药物分别处理沉默MTDH的非小细胞肺癌细胞系及对照组，发现当MTDH基因被沉默后，肿瘤细胞的化疗敏感性明显增强 [58] 。类似的结论在乳腺癌、结直肠癌等恶性肿瘤中也得到验证 [59] [60] 。WANG等的研究也证实了miR-22通过调控MTDH基因的表达介导骨肉瘤细胞的自噬，并影响骨肉瘤细胞对顺铂的耐药性 [61] 。

5. 小结与展望

虽然对骨肉瘤的治疗已由传统的手术及放疗、化疗发展到免疫治疗、光疗法等多种治疗方式，但关于免疫疗法等对骨肉瘤的治疗尚无明确疗效 [62] 。且骨肉瘤的肺转移及化疗耐药仍是影响骨肉瘤患者预后及5年生存率的重要因素。随着对骨肉瘤发病机制与恶性生物学行为的认识不断加深，越来越多的靶点及其对应药物得以研发。本文综述了MTDH基因的生物学特征、功能及其在骨肉瘤的发生发展中可能产生的影响。MTDH基因可通过PI3K/AKT、NF-κB、WNT/β-catenin、MAPK等信号通路参与骨肉瘤的增殖、侵袭、转移、新生血管的生成、EMT等恶性生物学行为过程。在乳腺癌、非小细胞肺癌、结直肠癌、肝癌等恶性肿瘤中，MTDH基因对其治疗及预后的影响已被证实 [63] [64] [65] 。因此，可将MTDH基因作为骨肉瘤治疗的重要研究靶点，针对MTDH及其上下游通路如circRNA、miRNA等展开研究，寻找可靠的干预靶点及高效通路，为骨肉瘤的治疗提供更多可能性。这对改善骨肉瘤患者的预后及生存质量具有非常重要的意义和应用前景。