F1Fo ATP合酶作为抗真菌药物靶点的研究进展

Progress of F1Fo ATP Synthase as an Antifungal Drug Target

摘要: 近年来，随着肿瘤化疗、免疫抑制剂及广谱抗菌药物的广泛使用，侵袭性真菌感染的发病率和死亡率在全球呈明显上升趋势，真菌感染已成为严重威胁公共卫生健康的病原体之一。2022年世界卫生组织(WHO)公布的真菌重点病原体清单，也进一步强调了真菌对人类的危害已经达到了危机点，必须引起全球范围内的高度重视。目前临床抗真菌药物种类有限、随之耐药性的产生，因此，寻找新的抗真菌药物靶点尤为重要。F1Fo ATP合酶，作为药物理想分子靶标，一直以来都是研究的热点。随着F1Fo ATP合酶亚基作用机制明了，表明F1Fo ATP合酶作为抗真菌药物靶点的巨大潜力。在此，我们收集整理近年来关于F1Fo ATP合酶的研究成果，从ATP合酶的各亚基展开，进而阐述各亚基的结构功能以及机制，综述各亚基作为靶点的潜在可能性，为抗真菌药物靶点的研究提供参考。

Abstract: In recent years, with the widespread use of tumor chemotherapy, immunosuppressants and broad-spectrum antimicrobial drugs, the morbidity and mortality of invasive fungal infections have shown a significant upward trend globally, and fungal infections have become one of the pathogens that pose a serious threat to public health. The list of fungal priority pathogens published by the World Health Organization (WHO) in 2022 has also further emphasized the fact that the danger of fungi to human beings has reached a crisis point and must be given high priority globally. The limited availability of clinical antifungal drugs and the consequent emergence of drug resistance have made the search for new antifungal drug targets particularly important, and F1Fo ATP synthase, as an ideal molecular target for drug discovery, has long been a hot research topic. With the clarification of the mechanism of action of the F1Fo ATP synthase subunit, it has been shown that F1Fo ATP synthase has great potential as an antifungal drug target. Here, we collect and organize the research results on F1Fo ATP synthase in recent years, start from the subunits of ATP synthase, and then elaborate the structure, function, and mechanism of each subunit, and review the potential of each subunit as a target, so as to provide a reference for the research of antifungal drug targets.

1. 引言

随着重症感染、恶性肿瘤、骨髓造血干细胞和实体器官移植及艾滋病的增多，广谱抗生素、放化疗、免疫抑制剂的大量应用，导致机体菌群失调，免疫系统受损。侵袭性真菌感染在全球范围的发生也随之增加，严重的真菌感染对本就免疫低下的人群来说无疑是一场生死攸关的考验。目前，临床常用抗真菌药物主要包括：氮唑类、多烯类、棘白菌素类及嘧啶类，且均存在不同的不良反应 [1] [2] 。根据WHO世界卫生组织发布的“重点真菌病原体”清单，真菌病原体对以上四类抗真菌药的耐药性也在上升。并且，由于抗真菌药物的耐药率上升及现有抗真菌药物在使用过程中的局限性，新的抗真菌药物的开发迫在眉睫 [3] [4] [5] [6] [7] 。由于真菌系真核生物，同人类关系密切，开发有效且无毒的抗真菌药物非常困难。因此，寻找新的药物作用靶点，对新药的研发和抗真菌治疗具有重要意义。

2. ATP合酶

ATP合酶，也称F1Fo-ATP合成酶，存在于几乎所有的生物细胞中，其主要存在于线粒体、囊泡膜和细胞膜上，参与细胞能量代谢，并可以缓解细胞能量紊乱，从而在细胞内的活性中发挥重要作用 [8] 。线粒体通过氧化磷酸化产生ATP供给机体能量，而线粒体ATP合酶是这一步骤的关键酶，该酶复合物由17个不同亚基组成，分为水溶性F₁部分和膜嵌入式F_o部分。在真菌中，酵母菌线粒体内的ATP合酶由17个不同的亚基组成，分为水溶性F₁部分和膜嵌入式F_o部分。突出膜外的F₁部分由α、β、γ、δ和ε5种亚基组成，而F_o部分则包括亚基b、OSCP (寡霉素敏感性赋予蛋白)、d、e、f、g、h、i/j、k，以及线粒体的亚基6、8、9。同时，酵母菌线粒体中还含有INH、STF1和STF2三种抑制剂复合物 [9] 。编码线粒体ATP合酶结构亚基的基因发生突变或者参与调控其生物合成和组装的基因发生突变均会引起线粒体疾病 [10] 。真菌F1Fo ATP合酶与人类的F1Fo ATP合酶高度同源，氨基酸序列高度保守，但结构上具有特异性，有望作为抗真菌药物作用的新靶点。本文将对真菌F1Fo ATP合酶各亚基的研究进展做如下综述。

2.1. F1亲水部分

水溶性F1区段位于基质中，由α、β、γ、δ和ε5种亚基组成。

2.1.1. α亚基

α亚基是F1Fo ATP合酶中极其关键的亚基之一，它和β亚基组合形成的6聚体(α3β3)是氧化磷酸化的催化位点 [11] ，与线粒体功能密切相关。因此，α亚基结构、功能的完整性对细胞内ATP的合成至关重要。国内外研究发现α亚基参与致病菌株对宿主感染过程的多种机制能，α亚基可能是菌株致病必不可少的 [11] [12] [13] 。

ATP1，是真菌F1Fo ATP合酶α亚基的编码基因，研究发现其与人类的F1Fo ATP合酶编码基因序列存在显著差异，提示其极有可能成为新型抗真菌药物作用靶点。进一步研究发现，尽管二者基因序列存在着显著差异，但翻译修饰后的氨基酸序列高度保守，同源性较高，这为α亚基的研究带来了枷锁。随着分子生物学技术的迅猛发展，有研究发现在棉花线粒体基因组中有两个编辑位点C1292和C415对ATP合酶的α和β亚基之间的相互作用很重要，与ATP合成相关 [14] [15] 。后续的研究中能否在转录的过程中有针对的抑制关键RNA的合成，以达到抑制真菌的效果，是研究者们关注的重要方向。

2.1.2. β亚基

β亚基不仅是F1Fo ATP合酶的重要组成部分，也是ATP合酶重要的催化靶点。目前，国内研究发现，在白念珠菌中β亚基通过调节碳源代谢对抗吞噬细胞杀伤作用，揭露了F1Fo ATP合酶β亚基参与白念株菌对宿主的感染过程以及其作用机制，为进一步筛选能够作用与β亚基的抗真菌药物提供了理论依据 [16] [17] [18] 。但遗憾的是，β亚基在真菌和哺乳动物中高度同源，其结构和功能存在着相似性，以该靶点作为抗真药物的筛选存在困难。已有研究报告通过高通量筛选(High Throughput Screening, HTS)与基于靶蛋白结构的虚拟筛选(Structure-Based Virtual Screening, SBVS)，获得一种β亚基小分子抑制剂S2-13，这是一种新结构、新机制的抗真菌化合物，对念珠菌属具有广泛活性，但其对白念珠菌和哺乳动物细胞的选择性较低，细胞毒性不容忽视 [19] 。总的来说，尽管S2-13-1具有较大的毒性，但因其良好的抗真菌活性，有良好的应用前景，为将来进一步筛选高选择β亚基小分子抑制剂提供了实践基础。

2.1.3. δ亚基

δ亚基作为ATP合酶中心茎(连接F1催化结构域和Fo翻译结构域)三大组成之一，在偶联质子跨膜转运和ATP的合成中发挥着重要作用。研究发现δ亚基是白念株菌感染所必须的，其通过影响相关毒力因子和相关代谢途径的下调，降低菌株的毒力水平，但却不影响胞内ATP的水平，这为δ亚基作为潜在治疗靶点提供了理论依据 [20] [21] 。已有研究通过基于受体生物大分子结构的虚拟筛选出一种可显著抑制δ亚基的化合物S1 (JNU-SM919, C₂₆H₂₉ClN₄O₂S)，即一种N-苯基哌嗪-1-甲硫酰胺的化合物。在小鼠实验中，S1可以显著抑制致死性白念株菌的感染 [20] 。遗憾的是，研究并未延申到人体临床实验，无法得知这种靶向药物可能存在的风险和不良反应，但值得肯定，小鼠实验的成功，预示着未来临床上δ亚基作为治疗靶点的可能性。

2.1.4. ε亚基

ε亚基是ATP合酶中心茎的一部分，但该亚基功能尚不完全清楚 [10] 。研究发现，在酵母中ε亚基的缺失，可以导致ATP合酶活性和F1结构域的稳定性降低。总的来说，ε亚基可能在真核生物ATP合酶F1结构域的组装发挥着重要作用 [22] 。此外，也有研究发现ε亚基似乎可以在哺乳动物ATP合酶中协助疏水性亚基c同F1结构域相结合 [23] 。尽管ε亚基的研究层出不穷，但以其作为抗真菌靶点药物的研究却几乎没有，主要原因是哺乳动物ε亚基与酵母菌ε亚基高度同源、功能等效 [24] 。

2.2. Fo疏水部分

Fo区域嵌入线粒体内膜，包括由核基因编码的亚基b、OSCP(寡霉素敏感性相关蛋白)、d、e、f、g、h、i/j、k、INH、STF1和STF2，以及线粒体基因编码的亚基6、8、9。

2.2.1. INH

INH (ATPase Inhibitor)是一种天然的抑制剂蛋白，与稳定因子STF1 (stabilizing factors 1)和STF2 (stabilizing factors 2)以F1-ATP酶的等摩尔比例组成抑制剂复合物 [25] ，在ATP酶活性的调节中直接发挥作用。INH的苯丙氨酸-17到苯丙氨酸-28的区域作用于F1结构对抑制酶活性至关重要，可抑制ATP水解，但不抑制ATP合成 [26] 。国外研究报告，酵母菌INH的缺失，导致ATP酶活性异常增高，随后出现酶活性失控，异常DNA的产生，细胞的凋亡 [27] 。相关研究表明，哺乳动物细胞中INH同源物——IFI，可以抑制酵母细胞ATP合酶的活性，但INH不能抑制哺乳动物ATP合酶 [28] 。STF1和STF2作为稳定因子可以增强INH的抑制作用，STF2蛋白与Fo部分结合，并帮助INH或STF1蛋白固定在F1亚基上。若缺乏STF2，INH无法有效与ATP合酶在线粒体膜断电时有效结合，使酶部分激活，导致线粒体膜的脆弱性或质子通透性 [29] ，且STF1和STF2蛋白在哺乳动物线粒体中没有同源物。这就为我们提供了一个思路：INH和其稳定因子能否作为ATP合酶的药物靶点，高选择性的杀灭真菌，而对机体不造成伤害。并且已有研究在秀丽隐杆线虫中发现了可转运至酵母线粒体的类似于INH的蛋白质，MAI-2 [30] 。

2.2.2. 亚基i/j

亚基i/j是由核基因ATP18编码的一个含有59个氨基酸残基的两亲性多肽，是真菌ATP合酶特有的亚基之一 [31] 。亚基i/j参与酶二聚体的逐步组装并促进新合成的亚基并入ATP合酶 [32] 。研究发现，白念珠菌缺失ATP18基因后，毒力、侵袭力和肝肾毒性下降，酵母相向菌丝相的转化也下降，对氧化应激的敏感性增高，细胞壁的结构和功能也有受损，这些变化在白念珠菌致病性降低中起关键作用 [33] 。亚基i/j是真菌特有的亚基，因此有望成为抗真菌药物新的靶点。

2.2.3. OSCP

寡霉素敏感相关蛋白(Oligomycin Sensitivity-Conferring Protein, OSCP)，作为一个柔韧的枢纽连接F1头部与外周茎部，防止催化头与Fo的空转。OSCP是ATP合酶催化和质子转运片段稳定的相互作用的核心。有研究表明OSCP稳定ATP合酶Fo和F1的连接，OSCP的N端与F1相互作用，C末端与Fo连接，抑制OSCP后，真菌ATP合酶Fo和F1连接的稳定性下降，可能会降低ATP合成/分解速率，对宿主的病情进展有益。此外有研究发现，OSCP是雌二醇及雌激素衍生物的特异靶点，以抑制线粒体ATP合酶的活动 [34] ；此外将酵母线粒体ATP合酶的OSCP替换成小鼠的OSCP后，ATP合酶对寡霉素的敏感性增高。OSCP在真核生物中高度保守，成为药物抗真菌靶点的可行性较低，但是否能作为真菌病毒治疗方法的靶点有待后续研究。

2.2.4. 亚基e/g

亚基e，由核基因ATP21编码，是一种内膜蛋白，其疏水性的N端可以锚定在膜上，而亲水性的C端则游离膜间 [35] 。亚基g，则由核基因ATP20编码，可以和亚基e形成异二聚体，在ATP合酶二聚体形成中起重要作用 [36] 。研究已证实，所有亚基e和亚基g的蛋白家族成员都含有一个保守GXXXG基因序列，其中G代表甘氨酸，X代表任何疏水性的氨基酸残基，其通常存在于跨膜片段中(即N端)，可以介导蛋白质–蛋白质相互作用(亚基e-N端GXXXG的突变可以导致亚基g水平的显著降低)。目前，关于亚基e-N端的功能的研究越发清晰——其N端疏水区(膜锚定区)的存在是稳定亚基g、亚基k和维持线粒体DNA所必需的。但N端的膜锚定区在亚基e的同源物中显示出高度的氨基酸保守性，这意味着单独以N端高保守的GXXXG基因序列为靶点的抗真菌药物很难成功。亚基e-C端亲水区分为卷曲的螺旋区和末端的C极端，但对其功能研究却不清楚。尽管有研究发现，螺旋区对卷曲线圈结构的形成有着重要的潜力作用，但由于其高度保守，故很难成为药物靶点。有趣的是，约40个氨基酸残基所形成的C极端区域虽然也具有保守性，但其与哺乳动物或果蝇亚基e几乎没有同源性 [37] 。这为亚基e的靶向抗真菌药的筛选带来了可能。

2.3. 调节因子

F1Fo ATP合酶的组装除了各种亚基的参与，还有调节因子的参与。

INAC (Inner Membrane Assembly Complex)，内膜组装复合体，可以同亚基c10环结合构成外周茎，还可以和由F1结构域、外周柄、亚基6、亚基8以及分子伴侣ATP10、ATP23组成的组装中间体结合。INAC功能的丧失导致F1结构域与膜积分Fo部分分离，故INAC可以促进外周茎的形成及其组装成ATP合酶 [10] 。已有研究发现，INAC和HSP70的失活阻断ATP合酶的形成，这表明这两种蛋白分子在F1结构域与外周茎的连接中起着部分重叠但至关重要的作用。相关研究已证实，INAC由INA17和INA22两种多肽组成，且目前为止，并未在人体细胞中发现同源物。有研究发现，缺乏Ina22会影响酵母菌的呼吸生长，因此是呼吸生长所需的线粒体蛋白；Ina22会显著降低ATP合酶对寡霉素的敏感性，因此是正确组装功能性F1Fo-ATP合酶所必需的 [38] 。同时，研究表明Ina17是一种线粒体蛋白，是一种被预测的前序，其显示出与Ina22结合形成的F1Fo-ATP合酶呈选择性关联。虽然Ina17和Ina22的明显同源性仅在真菌界被发现，但在人体线粒体中发现了许多不同的F1部分组装中间体，这表明具有类似功能的蛋白质可以帮助哺乳动物F1Fo-ATP合酶的组装。INAC能否成为抗真菌药物作为靶点，影响线粒体ATP合酶，有待后续深入研究。

3. 展望

近年来，随着广谱抗生素、皮质激素和免疫抑制剂的广泛应用，化疗和器官移植的增加，艾滋病的流行，侵袭性真菌感染发生率呈逐年上升趋势。目前临床上真菌的治疗主要还是依赖于氟康唑、两性霉素B等一系列经典药物，但其耐药性已经日益严重。因此，寻找新的药物作用靶点对抗真菌治疗具有重要意义。

目前，靶向F1Fo ATP合酶抗真菌药物作用靶点展示出了巨大潜力。ATP合酶为多亚基复合体，白念珠菌有18个亚基，而人类则有16个亚基，故白念珠菌与人类的F1Fo ATP合酶结构差异明显，具有特异性，极有可能作为抗真菌药物作用的新靶点。尽管真菌和人类基因的编码序列存在显著差异，但由于ATP合酶的整体结构在真菌到哺乳动物中相对保守、高度同源，故针对ATP合酶靶向药物的研究存在着桎梏。研究发现，部分亚基(如i/j亚基)和Fo相关蛋白调控因子(Stf1p和Stf2p)为真菌所特有的，尚未通过结构生物学或生化手段在哺乳动物中鉴定出其同源物。那能否以这些特有的结构为靶点，选择性地抑制真菌F1Fo ATP合酶呢？首先需要明确的是，靶向药物的研制，除了需要满足高选择性、高效性，还需要考量靶点在宿主内替代途径等多方因素。已有的研究表明，并不是所有的这些特有结构都有成为靶向药物的潜力。尽管这些特有结构存在着高选择性，但部分结构机制的深入发现无法满足其高效性。目前越来越多研究揭露F1Fo ATP合酶具体作用机制，但尚无文献报道F1Fo ATP合酶或其亚基作为抗真菌药物作用靶点。究其原因，F1Fo ATP合酶的复杂性、结构和功能的信息不足、导致靶向药无法兼顾高选择性和高效性。那如何筛选出这种高效性、高选择性的理想靶向药呢？目前抗真菌药物的发现主要仍然是通过筛选天然产物库或合成小分子库，但该方法成本高、周期长且常得到具有相似骨架的化合物，限制了其发展。已有研究通过高通量筛选与基于靶蛋白结构的虚拟筛选的优势，进行基于白念珠菌F1Fo ATP合酶亚基结构的虚拟筛选与活性验证，筛选出广谱抗菌作用的小分子抑制剂并进行结构优化，可以得到一种靶向亚基有效、广谱的小分子抑制剂。尽管这种小分子抑制剂可能成为具有良好临床使用前景的抗菌药物，但由于F1Fo ATP合酶在细菌、真菌和哺乳动物中是进化保守的，这种新结构、新机制的抗真菌化合物往往存在着严重细胞毒性风险。目前功能亚基(如β、δ)的小分子抑制剂已经证明了其显著广谱抗菌效果，但由于其风险性，还处于临床前研究阶段，只在小鼠体内进行了试验。随着高分辨率电镜、冷冻电镜等技术的进步，真菌F1Fo ATP合酶结构的研究也越发清晰。虽然真菌ATP合酶和哺乳动物高度同源，但研究发现，某些亚基(如e亚基) N端或C端存在保守的氨基酸序列，且在真菌中高度同源，并未在哺乳动物中发现同源物。

尽管目前尚无文献报道F1Fo ATP合酶或其亚基作为抗真菌药物作用靶点，但我们相信ATP合酶的靶向药具有良好的临床应用前景。相信随着各亚基机制和结构的透彻研究，相关靶向药物也会如雨后春笋般涌现。

基金项目

2023年四川省大学生创新创业训练计划项目(S202310632147, S202310632156)。