抗体偶联核酸药物的研究进展

Research Progress of Antibody-Oligonucleotide Conjugates

摘要: 核酸药物具有不可替代优越性和应用局限性，基于抗体的递送系统已成为一种有效的治疗策略，因此将抗体和寡核苷酸结合以有效融合前者的组织特异性优势和后者的靶点特异性优势已成为新的发展趋势。本文旨在论述制备抗体偶联核酸药物的关键技术及各自优缺点，为抗体偶联核酸药物的发展提供研究思路。

Abstract: Nucleic acid drugs have irreplaceable superiority and application limitations, and antibody has become an effective therapeutic strategy as the basis of delivery system. Therefore, the combination of antibody and oligonucleotide to effectively fuse the tissue-specific advantages of the former and the target-specific advantages of the latter has become a new development trend. This review aims to discuss the key techniques of preparing antibody-oligonucleotide conjugates, their benefits and drawbacks, and provide research ideas for the development of antibody-oligonucleotide conjugates.

1. 核酸药物的研究现状

核酸作为重要的遗传物质，处于分子生物学中心法则的上游。与在蛋白层面发挥药理作用的传统小分子化学药和抗体类药物不同，核酸药物(nucleic acid drug)高度依赖碱基互补配对原则参与基因转录和翻译过程，高效特异性地调控致病基因或RNA [1] ，具有设计方便、特异性强、不易产生耐药、利于快速反应等特点，可用于治疗病毒感染性疾病、心血管系统疾病、代谢类疾病以及肿瘤等多种疾病 [2] 。核酸药物通常由天然或修饰的脱氧核糖核苷或核糖核苷聚合而成，主要包括DNA、RNA、反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides, ASOs)和核酸适配体(nucleic acid aptamer)等，其中RNA包括小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)、小核糖核酸(microRNA, miRNA)、短发夹RNA (short hairpin RNA, shRNA)、信使RNA (messenger RNA, mRNA)、自扩增RNA (self-amplifying RNA, saRNA)和环状RNA (circular RNA, circRNA)等多种类型 [3] 。

Table 1. Marketed nucleic acid drugs

表1. 已上市核酸药物

自1998年第1个核酸类药物Vitravene被美国FDA批准上市后，多个核酸药物相继进入临床试验，但被批准上市的少之又少。在时隔15年之后，第3个也是首个全身给药的核酸药物Kynamro于2013年1月29日被美国FDA批准上市，这掀起了新一轮核酸药物的研究热潮 [2] 。截至2023年7月，全球上市的核酸药物有9款ASO药物、5款siRNA药物和1款核酸适配体，此外还有2款mRNA疫苗。这些核酸药物除了靶向肝脏，还可以应用于眼睛、大脑、肌肉和淋巴系统等，适应症包括有抗病毒性视网膜炎、家族性高血脂、脊髓型肌萎缩症、杜氏肌肉营养不良、淀粉样变性引起的多发性神经系统疾病、高乳糜微粒血症、急性肝卟啉病、高草酸盐尿症、新冠疫苗等 [4] [5] 。目前全球已上市的核酸药物具体情况如表1所示。

目前已上市和进入临床的核酸药物所使用的递送载体主要有纳米递送载体(NA)、脂质纳米颗粒(Lipid Nanoparticle, LNP)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、有机聚合物、金属纳米颗粒、细胞穿透肽(CPPs)等。其中较为典型的纳米药物递送系统(NDDS)为可控的靶向给药提供了一种很有前景的策略 [6] 。NDDS可通过有机或无机材料制备，如脂质、聚合物和金颗粒等 [7] ，其具有靶向递送肿瘤部位、血浆循环延长、药物有效载荷量大、制备过程中药物释放模式可控等优点 [8] [9] 。虽然这些传统递送载体已被证明有很大的应用优越性，但也存在生物稳定性差、内吞体捕获导致低效力、生物毒性和免疫原性等局限性 [10] ，限制了临床应用的发展。近年来，以抗体为基础开发的多种药物给药系统(DDSs)已成为一种有效的治疗策略，例如抗体融合蛋白(antibody fusion protein)、抗体偶联药物(antibody-drug conjugate, ADC)、双特异性抗体(bispecific antibody, BsAb)、抗体偶联寡核苷酸(Antibody oligonucleotide conjugates, AOC)，能够提高生物利用度、给药方便性、降低毒性，从而实现在癌症治疗中增强患者依从性、调节肿瘤微环境进行联合治疗的优越性 [11] 。其中，最为经典的便是抗体药物偶联物(antibody-drug conjugate, ADC)，是通过一个化学链将具有生物活性的小分子药物连接到单克隆抗体的特定部位，抗体作为递送载体将小分子药物靶向运输到靶标细胞中。ADC药物通过优化抗体的稳定性、毒性和药代动力学半衰期，设定合适的药物抗体比，获得良好的治疗指标。ADC药物与肿瘤细胞表面表达的抗原结合后，通过受体介导的内吞作用进入细胞，释放有效载荷杀死细胞，其不仅具有化疗的疗效，而且还能激活免疫效应细胞的ADCC和ADCP机制 [12] 。目前已有11种具有不同靶点的ADC药物已被批准上市，其适应症包括血液学肿瘤和实体肿瘤，最常见的不良反应包括周围神经病变、血液学毒性和肝毒性等 [11] 。

ADC药物在过去十年中发展迅猛，尽管其能够通过抗体实现高度靶向性，但由于其携带的是非选择性有效载荷所以仍会导致非特异性毒性。假如能够使用更精确的有效载荷，协同组合可能会产生更具靶向选择性和更安全的抗体偶联药物。核酸类药物便有极大潜力成为这类精确的有效载荷，因为它们能够通过归巢特定基因来阻止蛋白质的产生。相较而言，核酸药物虽具有选择性，但是血清稳定性差、膜通透性低、缺乏组织选择性，抗体则具有更长的半衰期以及良好的靶向递送特性，因此抗体–寡核苷酸偶联物(AOC)能够将核酸药物的高精度选择性与抗体的靶向递送性相结合，协同发挥两种技术的优势 [13] 。

2. 抗体偶联核酸药物的发展现状

2.1. 化学反应偶联抗体和寡核苷酸

“抗体作为递送载体的想法是很自然的，我们确实从ADC中吸取了一些经验，无论是分子设计方面还是生产制造方面”，Tallac Therapeutics公司的首席执行官洪万说，该公司致力于研发抗体偶联寡核苷酸(AOC)药物。ADC药物多年来的发展确实促进了AOC药物的兴起，因而目前最为成熟的偶联方法便是类似于ADC药物利用化学反应的直接偶联 [14] 。AOC的结构与ADC相似，主要由三部分构成：发挥组织靶向作用的载体、连接子(linker)、作为有效载荷(payload)的小核酸。AOC通过连接子和偶联技术将抗体和小核酸有效结合在一起，针对抗体靶向的靶标细胞和寡核苷酸特异性沉默的目标基因实现联合靶向治疗，同时解决不可靶向和小核酸药物的递送问题。成功获得这种通过直接偶联得到的AOC药物关键在于三个方面：有效载荷的效力、连接子的稳定性、偶联抗体和有效载荷的偶联技术 [15] 。

2.1.1. 有效载荷、连接子和偶联技术

ADC药物中的有效载荷大多是高细胞毒性药物，比如MMAE/MMAF、卡奇霉素、DM1/DM4、SN38/Dxd等，选择标准包括稳定性、溶解度和结合力，并且希望有效载荷在到达靶标部位之前在体循环中能保持高度稳定 [16] 。对于AOC药物来说，其有效载荷也就是寡核苷酸可以是单链或双链，可以包括一个或多个修饰过的核苷酸(例如2'-o-甲基糖修饰、嘌呤或嘧啶修饰)或者一个或多个经过修饰的核苷酸间连接产物。合理修饰过的寡核苷酸能够具有核酸酶抗性，能够减少毒性、改善细胞摄取效率和核内体逃逸，能够尽量减少TLR刺激或者避开模式识别受体。寡核苷酸的修饰常用的有2'-修饰的核苷，指在2'位置上有糖部分修饰的核苷。比如2'-4'双环核苷，其中糖的2'和4'位置被桥接；非双环2'修饰的核苷，其中糖部分的2'位置被取代；2'修饰核苷的非限制性例子包括：2'脱氧，2'-氟(2'-F)，2'-o-甲基(2'-O-Me)，2'-o-甲氧基乙基(2'-O-AP)等 [17] 。

连接子是将有效载荷和抗体连接起来的重要部件，它的化学性质和偶联位点对于药物的稳定性、药代动力学、药效学特性、治疗窗口等方面有至关重要的影响 [18] 。连接子应具有足够的稳定性和内化时快速裂解以释放有效载荷的能力 [19] 。连接子包括至少一个共价键，可以是单键比如二硫键或二硫桥，也可以是多个共价键。根据有效载荷释放机制，目前常用的分为可裂解和不可裂解连接子。可裂解连接子主要包括蛋白酶敏感型、pH敏感型、谷胱甘肽敏感型连接子，它们通常只在细胞内可切割，在细胞外环境中稳定。(1) 蛋白酶敏感型连接子通常由肽序列组成，主要包括缬氨酸–瓜氨酸或丙氨酸–瓜氨酸序列，长度可为2~10个氨基酸不等。(2) pH敏感连接子是一种在高或低pH环境中容易降解的共价连接剂，主要包括腙或环缩醛。(3) 谷胱甘肽敏感连接子主要包括二硫基，其包括至少一种氨基酸比如半胱氨酸残基 [17] 。不可裂解连接子通过与抗体的氨基酸残基形成不可还原的键，提高在血液中的稳定性，主要依赖于抗体的溶酶体降解以释放有效载荷，因此需要一个有效的内化过程和最佳的运输途径至溶酶体 [20] 。

与ADC药物相同，AOC药物的临床成功不仅取决于有效载荷的效力和连接子的稳定性，同样也取决于连接各部件的生物偶联技术。为了确保良好的药代动力学特性，需要有效载荷和抗体之间精确且位点特异性的偶联技术 [21] 。第一代和第二代偶联技术是基于内源性氨基酸的传统非特异性或随机结合的方法，使用三(2-羧乙基)磷酸盐(TCEP)等还原剂将抗体的链间二硫键部分还原，生成的位置异构的半胱氨酸和赖氨酸能够诱导产生多种DARs (DAR代表的是每个抗体上连接小分子药物的平均数量)。相比之下，第三代偶联技术大多是通过位点特异性结合天然或非天然氨基酸设计的，能够生成具有良好DARs的均匀的抗体药物偶联物，这种位点特异性工程偶联技术限制了药物在抗体之中的分布 [22] 。目前被广泛探究的偶联技术如表2所示 [15] 。

Table 2. Widely explored coupling techniques and reactions in antibody oligonucleotide conjugates design

表2. 抗体偶联药物设计中广泛探究的偶联技术和反应

针对AOC而言，广泛的直接偶联方法便是将一个可连接的基团添加到寡核苷酸上并直接偶联到抗体的赖氨酸、半胱氨酸或工程氨基酸上，这种方法可以使用在ADC中探索发现的多种功能不同的连接子，比如可裂解或不可裂解连接子、二硫键等 [23] 。其中，由Genentech公司开发的位点特异性半胱氨酸工程抗体—硫单抗，是一种能够控制抗体偶联药物中DAR的有效方法，其通过在抗体上引入一种工程位点特异性半胱氨酸提高了抗体偶联药物在体内的整体有效性。硫单抗通过利用不涉及结构二硫键的工程化反应性半胱氨酸，在抗体上实现所需位点的选择性和均匀修饰，进一步的，寡核苷酸可以通过SMCC和SPDB等连接子与硫单抗偶联 [24] 。相较于较大的鱼精蛋白或亲和蛋白复合物，这种偶联方法的优点是连接子较小并且对整体偶联产物的影响较小。但是这种方法制备所得AOC由于未加入溶酶体逃逸剂可能会导致寡核苷酸从溶酶体中缓慢逃逸，从而影响AOC的活性 [13] 。Junutula等人首先报道了一种硫单抗策略，用工程化半胱氨酸残基取代了anti-MUC16抗体重链114位的丙氨酸，工程化位置内的反应性硫醇能够与马来酰亚胺负载的连接子反应，合成的anti-MUC16 ADC在异种移植小鼠模型中表现出较好活性 [25] 。有文献提到，若是针对具体的siRNA这类的寡核苷酸，其连接子通常需要偶联到正义链，因为反义链是用于合成RNA诱导沉默复合物(RISC)以沉默基因的链。目前基于化学反应的直接偶联法具有最大的灵活性和成熟性，是制备AOC药物的首选方法 [26] 。

2.1.2. 发展情况

尽管目前有很多较为成熟的技术可以将核酸递送至肝细胞，但是针对其他组织细胞表面受体的技术还亟待完善，抗体作为递送载体虽仍处于早期发展阶段，但具有巨大发展潜力 [27] 。抗体和细胞表面受体之间的特异性相互作用能够将其传递到其他技术无法触及的组织或细胞亚群中，目前已有多种受体成功用于siRNA的靶向递送，包括HIV gp160蛋白、HER2、CD7 (T细胞标记物)、CD71 (转铁蛋白受体，在心脏和骨骼肌中高表达)、TMEFF2 [28] 。

通过化学反应偶联获得的AOC药物连接子小，相较于通过电荷作用偶联的AOC药物更加稳定，并且这种直接偶联法具备更大的灵活性，但仍需要合理选择连接子及其偶联技术。由于这种AOC药物不含有溶酶体逃逸剂，可能会导致寡核苷酸从溶酶体中缓慢逃逸，从而影响AOC活性，这一点不同于ADC，因此在工艺开发时需要重点考量 [29] 。制备传统的ADC药物面对的挑战包括有连接子带来的异质性、疏水性、聚集性、不稳定性，有效载荷的大小及其电荷对偶联物也有显著影响，这些挑战在AOC中都被放大了。比如ADC中被偶联的小分子药物分子量一般小于2 kDa，而AOC中被偶联的寡核苷酸分子量较大，可以大于10 kDa，这意味寡核苷酸对偶联物的物理和化学性质影响将大于小分子 [13] 。

目前全球在研的抗体偶联核酸药物主要出自四家公司，包括Avidity Biosciences、Dyne Therapeutics、Tallac、Denali，其中Avidity公司是开发AOC药物的先驱。首个进入临床的抗体偶联核酸药物为Avidity Biosciences的AOC1001，由3部分组成：靶向转铁蛋白受体1 (TfR1)的全长单抗、连接子、靶向DMPK mRNA的siRNA，适应症为强直性肌营养不良I型(DM1)。TfR1在细胞表面广泛表达，可将铁转运到细胞中，而肌肉细胞需要大量的铁，这使得靶向TfR1将药物递送至肌肉细胞效果显著。AOC1001通过靶向TfR1递送DMPK mRNA的siRNA来敲低突变DMPK的表达水平，从而释放MBNL使其发挥正常功能来治疗疾病 [30] 。Avidity Biosciences的AOC1020也于2022年9月进入临床，其包括靶向转铁蛋白受体1 (TfR1)的全长单抗、连接子、靶向DUX4 mRNA的siRNA，适应症为面肩肱型肌营养不良(FSHD)，该药物通过降低DUX4的表达治疗FSHD。同样的，ASOs也能够与抗体偶联发挥作用，比如与靶向CD44 (一种神经干细胞标记物)、EPHA2和EGFR的抗体偶联 [31] 。靶向骨骼肌等组织的抗体-siRNA/ASO偶联物，目前主要由Avidity Biosciences、Dyne Therapeutics公司开发 [28] 。全球目前在研的抗体偶联核酸药物具体情况如表3所示。

Table 3. Antibody-oligonucleotide conjugates under development

表3. 在研的抗体偶联核酸药物

2.2. 通过结合寡核苷酸的蛋白偶联抗体

目前较为成熟的递送载体如脂质体、无机纳米颗粒、聚合物等在临床应用中都受到一些限制，比如在血清中聚集、过大的颗粒大小、生物毒性、免疫原性等，基于结合寡核苷酸的蛋白将其递送的方法有潜力解决传统载体的这些问题。能够结合核酸的蛋白主要有两种：一种是通过电荷相互作用结合核酸的蛋白；一种是天然的RNA结合蛋白，能够以与序列无关的方式与双链RNA结合 [32] 。

2.2.1. 基于电荷相互作用结合寡核苷酸的蛋白

鱼精蛋白是一种天然的阳离子蛋白，可以把带负电的核酸分子络合成纳米级别的核酸颗粒，保护其不被血清中的酶降解，并且鱼精蛋白可以作为溶酶体逃逸剂促进寡核苷酸的胞质递送 [33] 。由于鱼精蛋白易于与细胞膜相互作用，因此它可以作为一种转染系统。无论是将DNA传递到细胞核，还是将mRNA传递到细胞质，鱼精蛋白都已被证明可以有效地保护运载物免受酶降解，改善其在细胞内的摄取 [34] 。鱼精蛋白包含三个结构域：中心是富含精氨酸的DNA结合结构域，包括一系列锚定序列，比如3~11个连续精氨酸残基以促进肽-DNA结合 [35] ，两侧是含有半胱氨酸残基的短肽链。除了鱼精蛋白，类似于八聚/九聚精氨酸、八聚组氨酸这样的具有多聚氨基酸序列的穿膜肽也常用于结合核酸序列 [36] 。

基于鱼精蛋白偶联抗体和寡核苷酸主要有两种方式，一种是直接表达出包含有抗体scFv和鱼精蛋白片段的融合蛋白(scFv/tP)。Huilin Zhang等人通过重叠延伸PCR成功构建了单链抗EGFR抗体(scFv)和鱼精蛋白片段(tP)融合蛋白(scFV/tP)的表达载体，并转入大肠杆菌TOP10F’中进行表达。利用该载体将人翅样基因(hWAPL)的siRNA有效递送入宫颈癌HeLa细胞中，hWAPL mRNA表达水平降低97.23%，HeLa细胞增殖能力下降66.71%，为EGFR阳性宫颈癌的靶向基因治疗提供了一种新策略 [37] 。另一种则是利用sulfo-SMCC这种双功能交联剂，其中的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS ester)能与伯胺反应形成稳定的酰胺键，马来酰亚胺与疏基反应形成稳定的硫醚键，从而sulfo-SMCC既能够通过氨基与硫酸鱼精蛋白偶联，又能够通过半胱氨酸残基与抗体偶联，进而实现抗体与寡核苷酸的偶联。Nicole Bäumer等人利用sulfo-SMCC和鱼精蛋白开发了一种具有靶向抗体并且能够通过静电络合保护siRNA的递送载体，将功能性siRNA递送到AML细胞中，特异性沉默AML中DNMT3A和FLT3两个致癌基因，从而抑制AML细胞系的体外克隆生长及体内模型中的肿瘤生长，显著提高小鼠的存活率。通过这种方法所得的递送载体比直接抗体-siRNA偶联物具有更高的稳定性，组装过程中相对较大的靶向抗体被迫分布在纳米载体球壳外部，而偶联的鱼精蛋白则保护着siRNA/游离鱼精蛋白的核心结构，构成了一个稳定的球形结构。这种载体能够以最佳的组分比例在水溶液中自发组装实现静电平衡，并且也可以应用于其他复杂的阴离子分子 [38] 。但是这种偶联方式由于抗体与寡核苷酸的结合是通过可逆的离子相互作用启动的，因此很难控制准确的寡核苷酸–抗体比例(OAR)，而且在pH或盐浓度显著变化时偶联物的稳定性也会发生较大变化 [39] 。

2.2.2. RNA结合蛋白

RNA结合蛋白(RNA-binding protein, RBP)通常被认为是通过一个或多个RNA结合结构域(RBD)来结合RNA并改变结合RNA命运或功能的蛋白质。RNA与蛋白相互作用一般是由对于RNA有精确结合作用的蛋白基序发挥作用，并且负责RNA识别的结构具有相当大的多样性，RNA结合结构域数量与结构组合上的多样性使其可以识别多种多样的底物。RNA结合蛋白种类有很多，比如TRBP [40] 、Dtat [41] 、PKR [42] 等。

类似的，基于RNA结合蛋白偶联抗体和寡核苷酸主要也有两种方式，直接表达包含有抗体和RNA结合蛋白的融合蛋白，以及利用sulfo-SMCC等交联剂将分别表达的抗体和RNA结合蛋白连接。Ghulam Hassan Dar等人设计了一个包含有RNA结合蛋白的dsRNA结合域(TRBP2)和ErbB2结合体(AF)的融合蛋白，它能够选择性地将siRNA运输到过HER-2表达的癌细胞和组织中，显著沉默参与细胞增殖的选定基因，抑制了肿瘤增殖 [40] 。由于寡核苷酸本身带有负电荷，因此载体需要正电荷来对其保护，但在给药和体内循环的过程中，应避免带有多余的正电荷，以减少血清蛋白的聚集、毒性和非特异性吸附 [43] 。因此，Yifan Yang等人设计了一种优化的siRNA递送平台，主要通过由pH敏感型电荷屏蔽序列、蛋白酶裂解位点以及超电荷聚多肽三部分组成的可激活超电荷聚多肽(activatable supercharged polypeptide, ASCP)，实现将各种生物活性物质(包括多肽、蛋白、小分子化合物、siRNA)靶向递送进入肿瘤细胞质内并发挥其生物功能。其中，作者将ASCP融合到一个双链RNA结合域(RBD)上，主要筛选了四种RBD：MS2、dTAT、TAT、PKR，结果显示PKR具有最好的作用效果，其偶联siRNA后的基因沉默效果与Lipo3000相当，能够显著沉默靶标基因从而获得最佳的治疗三阴性乳腺癌(TNBC)效果 [42] 。

2.3. 通过亲和性连接和核酸杂交偶联抗体和寡核苷酸

相较于前面介绍的两种偶联方式，这部分的两种方法相对而言应用较少。第一种是通过Avidin与Streptavidin−Biotin进行的偶联，利用寡核苷酸上标记的生物素和亲和素之间的强相互作用将抗体与寡核苷酸偶联。具体步骤可以将硫醇修饰的DNA化学连接到马来酰亚胺激活的链霉亲和素上，再与各种生物素化蛋白非共价连接。进一步的，可以直接利用链霉亲和素的四个生物素结合位点将生物素化的抗体和生物素化的寡核苷酸直接相连 [13] 。这种方法制备所得偶联物优点是在体内具有较好稳定性，阳离子复合物会因为盐浓度变化而聚集在体内，但生物素复合物对这种影响具有耐受性。不过虽然这种方法结合效果较强，但它仍然需要用到上述所提到的直接偶联的方法，制备步骤也较为繁琐 [44] 。

第二种方法是将一条单链寡核苷酸首先偶联到抗体上，另一条互补链通过杂交方式偶联以形成一个双链AOC。小分子药物也可以通过插入双链寡核苷酸来装载，或者直接偶联到互补链上 [45] 。双链杂交的动力学比点击化学和其他共轭方法快几个数量，因此这种方法具备优越的速率和特异性 [46] 。寡核苷酸的长度对于杂交方法非常重要，如果序列过短，双链结构在血浆中会不够稳定；如果序列过长，会比较容易形成二级结构 [47] 。这种杂交技术在诊断方面非常有应用前景，但用于生产治疗性药物则工艺挑战性较大。

3. 抗体偶联核酸药物的展望

抗体偶联核酸药物最初是作为一种诊断工具，现在已经逐步发展为新的治疗方式。它能够利用单克隆抗体特异性靶向组织和细胞的优势，将其与小核酸靶点特异性的优势相结合，解决目前小核酸药物仅能通过LNP (脂质纳米颗粒)、GalNAc (N-乙酰半乳糖胺)递送系统靶向肝脏的问题，将这类药物的治疗潜力扩大到肝脏之外 [48] 。比如Sugo等人利用靶向转铁蛋白受体1 (TfR1)的抗体将寡核苷酸递送至骨骼肌和心脏组织，他们在啮齿动物中证明了该TfR1抗体片段(Fab)-siRNA偶联物能够减少肌肉中Mstn mRNA的表达 [49] 。在此基础上，Barbora等人在非人类灵长类动物中进一步验证靶向TfR1的AOCs的药理活性，结果表明mRNA在骨骼和心脏(横纹)肌肉中沉默效果最大，在其他主要器官中最小或没有沉默活性。AOCs的组织PKPD显示，mRNA的沉默活性主要是由横纹肌中受体介导的siRNA递送驱动的，因此横纹肌与其他组织相比具有明显的选择活性 [50] 。可见AOCs PKPD特性确实能够扩大至更高级别物种。AOCs平台的另一关键优势是一种单一抗体可以用于一种组织类型中的多种疾病，其中寡核苷酸成分可以根据治疗靶点进行设计更换。这些不可替代的优势为抗体偶联核酸药物的发展奠定了坚实基础。

作为一种前沿技术，抗体偶联核酸药物也存在着诸多挑战。无论是非偶联、配体偶联还是纳米载体包裹的寡核苷酸，都会经历从早期核内体(EEs)运输到晚期核内体(LEs)，然后到下游多囊泡体(MVBs)，最后到溶酶体(LYs)进行降解的过程 [51] 。整个过程中，寡核苷酸经历了pH (7.4~4.5)的环境变化，并且由于寡核苷酸是聚阴离子大分子，逃逸核内体脂质双分子层到达胞内是一个主要问题。因此，利用化学修饰提高寡核苷酸的稳定性和生物利用度 [52] ，以及解决核内体逃逸成为影响寡核苷酸治疗效果 [53] 的限制因素。目前很少有报道成功克服了这两大难关，并且核内体逃逸的机制可能会导致核内体破裂，将大量的腔内内容物释放到细胞质中，激活先天免疫系统和其他毒性途径，从而缩小寡核苷酸治疗指数 [54] 。因此，为了解决核内体问题，保持好增强核内体逃逸以获得更好疗效和安全性之间的平衡是至关重要的 [55] 。这些也均是抗体偶联核酸药物未来发展亟待解决的问题。

展望未来，相信随着抗体和核酸药物领域的发展，寡核苷酸将能够不断提高稳定性、膜通透性和核内体逃逸能力，连接子将不断被改进而更具优越性 [13] ，偶联技术将不断进步而更好地开发新型偶联物，这些进展都将为抗体偶联核酸药物提供新的发展机遇，使之成为精准医疗的重要武器。

NOTES

^*通讯作者。