代谢组学在创伤性颅脑损伤中的研究进展

Research Progress of Metabonomics in Traumatic Brain Injury

摘要: 创伤性脑损伤(Traumatic Brain Injury, TBI)作为世界上最常见的后天性脑损伤，是世界上最主要的死亡和致残原因之一。由于多种原因的受伤因素以及大脑的复杂性，创伤性颅脑损伤可以诱导多种病理生理学机制的改变。因此早期的诊断以及良好的预后治疗TBI的迫切问题。代谢物作为生物体内的主要组成部分，参与了各种循环途径。代谢组学技术通过检测出不同代谢物浓度变化反应生物某一时间点生理、生化状态的准确信息。可以用来诊断疾病的严重程度、损伤机制、监测治疗反应及评估预后等。当前的代谢组学分析平台已能够检测和量化小浓度代谢物，使得我们评估颅脑损伤更加客观化、精细化。本文综述了代谢组学作为独立平台在临床环境中对于TBI的诊断、评估预后的前景。

Abstract: Traumatic brain injury (TBI), as the most common acquired brain injury in the world, is one of the most important causes of death and disability in the world. Due to various injury factors and the complexity of the brain, traumatic brain injury can induce changes in a variety of pathophysiologi-cal mechanisms. Therefore, early diagnosis and good prognosis are urgent problems in the treat-ment of TBI. As the main component of organism, metabolites participate in various circulation pathways. Metabonomics technology reflects the accurate information of biological physiological and biochemical state at a certain time point by detecting the changes of different metabolite con-centrations. It can be used to diagnose the severity, evolution, treatment and prognosis of the dis-ease. The current metabonomics analysis platform has been able to detect and quantify small con-centrations of metabolites, making our assessment of brain injury more objective and refined. This article reviews the prospect of metabonomics as an independent platform for evaluating TBI in clinical settings.

1. 引言

创伤性脑损伤主要是由于外界因素对颅脑产生的强大冲击力导致的认知障碍和神经损伤 [1] 。伴随着人口老龄化以及道路事故发生率的迅速增长，全球创伤性脑损伤的发生率也在不断增加，有研究统计，每年全球TBI的发生率达5000万例 [2] 。目前，国内TBI每年可造成近数十万人死亡，数十万人残疾，是我国人口中最具威胁性的致死因素 [3] 。由于颅脑损伤具备高致残率和高死亡率的特点，如果患者不及时接受规范化治疗，将导致严重后果，因此早期、准确的临床诊断及预后评估是保证患者生命质量的关键 [4] 。我国现阶段主要采取的是通过神经影像学和临床经验相结合的方法来对患者进行早期TBI的诊断以及评估患者的预后。但是由于个体异质性和大脑受损程度的差异，每个患者所表现出的临床表现也有所不同，因此它们在某种程度上缺乏一定的敏感性和特异性，目前还无法普遍适用于不同程度TBI的治疗过程 [5] 。同时不仅对于诊断，预后的评估同样也是临床上的一大难点，由于个体化的差异，年龄、性别、基础疾病等都对患者的预后有着不同程度的影响，有研究表明，同样损伤程度的成年TBI患者，随着年龄的增长其预后逐渐变差 [6] ，而男女之间由于存在一些激素分泌的差异性，也同样会对预后产生一定的影响 [7] 。因此一个可靠的生物标志物来帮助诊断TBI及评估预后将对临床医生有巨大的帮助。代谢物作为生物体内的主要组成部分，参与了各种循环途径，当前的代谢组学技术已能够检测和量化小浓度代谢物 [8] 。这将使得临床医生们在TBI的治疗上具有更显著的优势。本文就代谢组学作为独立平台在临床环境中对于TBI的诊断、评估预后的前景展开综述。

2. 代谢组学基本特征和研究方法

代谢组学(metabonomics)的概念最早是1999年由英国学者Nicholson提出，认为代谢组学是生物体中所有代谢物质对生理和病理生理刺激的代谢反应的表现 [9] ，模仿蛋白质组学和基因组学的研究思路，在一定条件下，可以对生物所含代谢物整体进行定性和定量分析。代谢组学是后基因组时代的研究热点，既能反映基因及其作用的下游改变，又能表现出环境因素的上游变化，能够直接、准确地反映生物体系的整体状态 [10] 。代谢组学是生物体中所有代谢物质对生理和病理生理刺激的代谢反应的表现，与基因组学和蛋白质组学等其他组学相比，代谢组学的优点是：代谢物水平上生物体的微小差异将被放大；代谢物的种类较少；代谢物的变化可直接反映机体的生理和病理状态。这可以为疾病的早期诊断和适当的治疗提供机会，从而增加成功治疗或治愈的可能性。

如今，代谢组学已被广泛应用在了生命科学的诸多重要领域。目前用于代谢产物的生物样本主要有血浆、唾液、脑脊液(CSF)、尿液、痰液、粪便、支气管肺泡灌洗液、泪液、呼出气冷凝液等 [11] 。代谢组学的出现重新定义了生物标志物的概念，使其不仅能够量化代谢产物，还能够识别疾病的代谢模式，也称为生物模式或代谢指纹 [12] 。

代谢组学的研究方法主要分为两大类：非靶向代谢组学，一般分析样品中的所有代谢产物；靶向代谢组学，主要测量特定代谢途径中的代谢物或其衍生物 [13] 。代谢组学的研究过程主要包括：1) 样品的收集以及预处理，2) 样本检测，3) 数据处理与分析，4) 差异代谢物的相关生物学意义阐释 [14] 。

3. 常用的代谢组学分析平台的比较

代谢组学研究过程中所用到的分析平台主要包括以下两类，检测物代谢平台如：核磁共振光谱(Nuclear Magnetic resonance spectroscopy, NM)和质谱(Mass Spectrum, MS)；分离代谢物平台如：液相色谱(Liquid Chromatography, LC)和气相色谱(Gas Chromatography, GC) [15] 。近年来随着对代谢组学研究的不断深入，不同平台之间相互联用的技术也逐渐流行，如气相色谱–质谱(Gas Chromatography-Mass, GC-MS)和液相色谱–质谱(Liquid Chromatography-Mass, LC-MS)，其原因主要是联用后的代谢组学平台技术在具备高灵敏度的同时也鉴别高准确度。

气相色谱–质谱(GC-MS)可以用来识别低浓度的代谢物，但其缺点在于分析非挥发性化合物时的效果相对较弱，因此对于热敏化合物的分析相对不足。同时由于在分析样品时，样品需要进行衍生化，因此在分析样品时只能分析具有热稳定性和挥发性的小分子 [16] 。随着对代谢组学平台研究的不断进展，我们也发现了GC-MS的二维色谱方法。通过使用二维色谱法，可以增强代谢物的鉴定效果，从而检测出多种在正常GC-MS中无法鉴定的代谢物 [17] 。

液相色谱–质谱(LC-MS)是一种功能性强大并且灵敏度高，无需高温并且仅需少量样本即可检测代谢物的代谢组学分析技术，并且LC-MS具有极高的敏感性，甚至可以检测出小于1 pg的分子 [18] 。适用于非极性化合物、半极性化合物、非挥发性化合物以及热不稳定化合物，但其仍存在缺陷，如它易产生跨平台变化或批次效应，不能测定不形成分子离子加合物的有机化合物 [19] [20] 。

4. 代谢组学在TBI中的潜在应用前景

现如今对于TBI的诊断和预后评估多采用格拉斯哥昏迷评分(GCS, Glasgow Coma Scale)和神经影像学的结合，但由于大脑的异质性和受损程度的不同，在临床上很容易出现漏诊或误诊，特别是对于早期颅脑损伤的鉴别，因此对于轻、中度的TBI诊断具有一定的挑战性 [21] 。进一步寻找可以作为诊断TBI的生物标志物的研究显得尤为重要。代谢物可反映生物体内的一些微小变化，较其他临床表现相更加可靠，在诊断TBI严重程度及评估预后具有更高的敏感性 [22] 。同时代谢组学可以通过代谢谱对患者进行聚类，以减少异质性 [23] 。更多的研究表明，通过代谢组学技术分析的小分子代谢物可以找到容易产生后遗症的患者，然后我们可以对其进行有针对性的康复治疗 [24] 。

代谢物在区分局灶性和弥漫性颅脑损伤过程中也具有很高的价值 [25] 。代谢组学可以定量测量脑损伤，因为代谢产物的浓度和类型随着受损区域的变化而变化，甘氨酸作为脑干和脊髓中的重要抑制性神经递质，可很好的反映出脑干和脊髓的损伤程度 [26] ，丙酰肉碱和胆碱反映了海马区的损伤程度 [27] 。这将更简便的对患者进行分类及预测结果。特别在目前缺乏识别特定解剖学损伤的神经影像技术的情况下，找到可以伴随TBI损伤的特定解剖部位的变化而发生变化的代谢物将对临床上明确诊断患者类型及评估患者预后具有深远意义。

代谢物还具有区分原发性和继发性颅脑损伤的作用。其中原发性损伤主要指神经和血管结构的机械性损伤，继发性损伤则为进一步的细胞死亡。有研究提出某些离子、第二信使、神经递质和糖酵解中间体可以作为区分原发性和继发性颅脑损伤的潜在生物标志物 [28] 。但是现阶段对于继发性损伤相关方面的生物标志物的研究数据并不充分，因此下一步我们可以侧重于对继发性损伤有关的代谢物进行研究，这将有助于部分患者进行靶向和康复的治疗。

5. 临床TBI患者中代谢组学的研究

代谢物–生物标志物在探索TBI的病理、生理机制中可提供帮助。有研究通过分析TBI患者血浆中代谢物发现了重型TBI (sTBI)患者多种代谢物或其参与的代谢途径均为降低趋势，揭示了TBI患者代谢物与脑血流量和能量状态之间具有对应关系 [29] 。

代谢物–生物标志物检测有助于对TBI严重程度进行分类。如Matej等 [30] 通过对比不同程度的TBI患者与急性骨科非脑损伤患者的代谢物发现辛酸(OA)、癸酸(DA)和2,3-双磷酸甘油酸(2,3-BPG)与TBI的严重程度具有密切的联系。其中，这些代谢物的含量变化与中度和重度TBI的联系更为紧密，轻度TBI的变化范围明显小于sTBI。研究表明这些代谢物的含量变化程度与TBI的严重程度成正比。为了找出代谢物与TBI预后的关系得出了两组结果，通过格拉斯哥预后评分(GOS, Glasgow Outcome Scale)，分别是不利(GOSe ≤ 4)和有利的结果(GOSe > 4)，发现了只有辛酸(OA)和癸酸(DA)与TBI的预后有关，认为其可能与中链脂肪酸(FA)容易通过血脑屏障(BBB)并可在BBB间双向运输有关，但是并未明确指出2,3-双磷酸甘油酸因何种原因与预后无关。由于此研究仅对比了骨科损伤和TBI患者的血浆代谢物的变化进而得出与TBI损伤程度及预后有关的代谢物，但未与严重损伤的全身反应代谢物相对比，未能明确其对TBI有多大程度上的特异性。Jeter等 [31] 采取GC-MS和LC-MS的技术，通过比较支链氨基酸(BCAAs，即缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸)在TBI、骨创伤患者和健康人的血浆代谢产物，发现与健康人相比，轻度TBI患者血浆中的BCAAs略有降低，而重度TBI患者的BCAAs进一步降低。而只有甲基戊二酰肉碱在重度TBI患者的血浆水平中是升高的，这些研究发现都将对我们明确区分TBI的严重程度提供了很大的帮助。

代谢物–生物标志物对评估预后及后续临床诊疗计划也提供了帮助。有研究提出N-乙酰天门冬氨酸(N-Acetylaspartate, NAA)和乳酸可作为预测短期临床结果的生物标记 [32] 。Marino [26] 等通过质子磁共振波谱成像(1H-MRSI)对创伤48~72小时的患者进行检查，发现了TBI患者中NAA的比率显著低于正常对照组，而乳酸的比率则显著高于正常对照组，同时NAA和乳酸值与就诊时的格拉斯哥昏迷量表和3个月时的格拉斯哥结果量表密切相关。Barkhoudarian等 [33] 证实了血清乳酸/蛋氨酸比值与GCS评分呈负相关，与伤后3个月GOS评分呈正相关。以上研究表明，乳酸可作为脑损伤后的严重程度和疾病结局的早期反应的重要指标。Yi, L等 [34] 通过对比有认知障碍(阳性组)、无认知障碍(阴性组)的TBI患者和健康对照组的血清代谢物，发现在阳性组和对照组之间具有20组代谢物具有显著不同的变化，而最终只有九种血清代谢物可以区分以上三组患者，其中阳性组与阴性组相比，阴性组中花生四烯酸、丝氨酸、苯丙氨酸和半乳糖显著降低，在健康对照组中只有半乳糖是显著降低的，焦谷氨酸、棕榈酸、亚油酸、柠檬酸和2, 3, 4-三羟基丁酸酯均显著增加。这项研究指出颅脑损伤后的认知障碍与氨基酸和脂质的代谢异常改变有关。但由于该研究纳入的可用患者的数量相对较少，所以证据的准确性有所不足，今后我们仍需在该研究的基础上进一步探索。

6. 动物TBI模型中代谢组学的研究

代谢组学研究在TBI动物模型中也被广泛研究。吕柳等 [35] 使用超高效液相色谱–高分辨质谱联用技术通过对比TBI模型大鼠和正常大鼠的脑组织和血浆中代谢物，发现了TBI大鼠存在酪、苯丙和色氨酸的生物合成以及花生四烯酸、脯氨酸、精氨酸、酪氨酸和嘌呤代谢的紊乱。我们可以依据以上不同代谢物对应的含量变化联合临床经验对颅脑损伤进行明确诊断，并判断患者的损伤程度以及损伤时间。但是该研究并未明确表明这些代谢物与TBI患者的预后是否有关。

Zheng Fei等 [36] 通过使用气相色谱/质谱(GC/MS)对受控皮质影响(CCI)大鼠组和假鼠组的血液样本进行分析，发现了血浆中的半乳糖、脯氨酸、肌酐、磷酸、L-缬氨酸、β-羟基丁酸、亚油酸和花生四烯酸可作为诊断急性TBI的潜在生物标志物。而且该研究首次证明了半乳糖可以作为急性TBI的生物标志物候选物。大大提高了急性TBI的早期诊断和治疗的价值。

Zhang G等 [37] 通过分析创伤性颅脑损伤大鼠血清代谢物发现在TBI损伤后三羧酸循环的中间产物柠檬酸会迅速增加，表示脑外伤可导致能量代谢紊乱，基质供应和能量消耗不匹配。且代谢物中的辛酸、癸烯酸可评估TBI的损伤程度。

Zheng Fei等 [27] 通过代谢组学和生物信息学联合代谢产物–蛋白质网络分析，对CCI大鼠海马急性期引起的代谢波动预测颅内TBI的发病机制。Viant等 [38] 通过对损伤后大鼠的脑组织样本和血浆进行研究，发现海马和皮层中抗坏血酸、磷酸胆碱和N-乙酰胺的水平均降低。但是该研究未能发现血液样本的显著变化。

7. 总结与展望

现如今随着代谢组学技术的成熟以及我们对颅脑损伤认识的不断深入，代谢组学方向的研究正不断完善。通过对于不同代谢物的挖掘与探索，我们目前已初步找出了一些与TBI具有紧密关系的代谢物。但是在实验过程中仍旧存在一些难以解决的问题，特别是对于多发性损伤的患者，这类患者的体内存在多种代谢物质的升高，在这种情况下我们无法准确的判定何种代谢物质对于TBI患者的诊断以及评估预后具有特异性。同样现存的一个问题是当前没有一种特定的代谢物质可以在TBI患者的疾病进展全程中具有高度的敏感性和特异性，往往需要联合多种物质进行判断。对于我们来说，最理想的代谢物质应具有高度的特异性和敏感性，并且不易受到患者个体化差异的影响 [39] 。因此我们在利用已知的代谢物对颅脑损伤进行诊断和评估预后的同时也需要我们不断探索新的TBI相关代谢物质。

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献

刘智：负责论文撰写、论文修改及相关参考文献收集；韩光魁：负责论文修改及相关参考文献收集。

NOTES

^*通讯作者。