早期诊断NEC无创性生物标志物的研究进展

Advances in Non-Invasive Biomarkers for Early Diagnosis of NEC

摘要: 坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis, NEC)是新生儿常见的消化系统疾病，尤其多见于早产儿和低出生体重儿。NEC起病隐匿，进展快，可迅速发展为爆发性NEC，其死亡率高达50%，且存活患儿容易出现各种与之相关的严重后遗症，严重影响患儿的生存质量。因此，早期诊断NEC显得尤为必要。本文就目前关于无创性生物标志物在NEC早期诊断中的研究进展作一综述。

Abstract: Necrotizing enterocolitis (NEC) is a common digestive disease in newborns, especially in premature and low birth weight infants. NEC has a hidden onset, rapid progression, and can rapidly develop into explosive NEC, with a mortality rate of up to 50%. Surviving children are prone to a variety of related serious sequelae, seriously affecting their quality of life. Therefore, early diagnosis of NEC is particularly necessary. This article reviews the progress of non-invasive biomarkers in the early diagnosis of NEC.

1. 引言

坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis, NEC)是新生儿常见的严重胃肠道疾病，影响2%~13%的早产儿，死亡率高达50%，且存活患儿容易出现肠狭窄、短肠综合征及神经系统发育迟缓等并发症 [1] [2] 。NEC病初症状隐匿，但可迅速发展为爆发性NEC，甚至出现肠穿孔等急腹症，因此早诊断、早治疗对降低患儿病死率及预后不良发生率有极其重要的意义 [3] [4] 。目前NEC的诊断主要基于改良的Bell分期标准，根据临床表现、实验室检查、放射学或超声检查进行诊断 [5] 。但血清生化检查通常在NEC发作后才出现异常，且为侵入性操作，腹部X片提示门静脉积气或肠壁积气时疾病往往已处于严重阶段，不利于早期诊断和治疗。因此需要寻找可以早期识别NEC并监测疾病进展的生物标志物。本文对无创性生物标志物在NEC早期诊断中的研究进展进行讨论。

2. 早期诊断NEC无创性生物标志物

2.1. 粪便钙卫蛋白

钙卫蛋白(fecal calprotectin, FC)是一种胞质蛋白，与钙锌具有良好的亲和性，由中性粒细胞、巨噬细胞等炎细胞表达，当肠道炎症激活时释放，且容易在粪便中检测 [6] 。一项纳入10项研究的Meta分析发现FC在诊断NEC时的敏感性、特异性、诊断优势比及AUC分别为0.86 (95% CI: 0.80~0.91)、0.79 (95% CI: 0.75~0.83)、34.78 (95% CI: 15.30~79.07)和0.92，证实了FC是一种很有前途的NEC早期预测标志物，在新生儿中具有很高的诊断价值 [7] 。Mac等以疑似NEC但腹部平片未见异常的患儿为研究对象，按是否发展为NEC进行分组后发现，NEC组患儿粪便FC水平明显高于非NEC组 [8] 。Pergialiotis等同样发现NEC患儿粪便FC水平明显升高，但其认为FC作为NEC诊断标志物的临界值尚需进一步研究 [9] 。同时，有研究认为早产儿在出生后1周内粪便FC在个体间和个体内差异很大，这限制了通过连续监测粪便FC水平来早期识别诊断NEC [10] 。有研究认为226 ug/g及247 ug/g两个临界值阳性预测值均较低(<0.6) [11] 。Hong等研究认为，新生儿FC水平差异很大，NEC患儿在发病前及发病时均出现FC水平升高，且显著高于脓毒症患儿，FC辅助NEC诊断时临界值为1086 ug/g，特异性75%，敏感性93.3%；区分NEC患儿与脓毒症患儿时临界值为238 ug/g，特异性83% [12] 。这些研究提示FC在早期诊断NEC方面有一定价值，但由于FC个体间水平差异很大，仍需进一步研究其与NEC的关系。

2.2. 脂肪酸结合蛋白

肠脂肪酸结合蛋白(Intestinal fatty acid-binding protein, I-FABP)是参与脂肪酸代谢的特异性胞质蛋白，在肠壁缺血时肠细胞膜完整性破坏，I-FABP被释放入血，并从尿液中排放 [13] 。Coufal等发现，与健康婴儿相比，I-LABP在NEC早期就出现显著升高，提示即使在NEC出现明显症状之前就可以检测到肠道粘膜损伤和强烈的炎症反应 [14] 。Ahmed等进一步发现尿I-FABP可以鉴别Bell’s分期 [15] 。其他研究表明NEC发病7天内的尿I-FABP浓度均高于非NEC患儿(I-FABP > 13.3 ng/mL，预测NEC的敏感性60%，特异性78%)，且在NEC诊断3天内具有更强的预测性(I-FABP > 13.9 ng/mL，预测NEC的敏感性为65%，特异性84%) [16] 。同时研究发现血浆I-FABP辅助诊断NEC具有很高的特异性，但灵敏度中等；而尿I-FABP在NEC早期诊断中价值有限，联合其他分子标志物或检测(粪便FC或腹部X片等)可能具有更大的应用价值 [17] 。Saran等发现尿I-FABP与肌酸的比值在3.6 pg/mmol时诊断2期及3期NEC时敏感性及特意性分别为96%和99.5%，优于单独尿I-FABP (临界值1800 pg/ml，诊断2期及3期NEC敏感性88%、特异性82%) [18] 。以上研究提示多种生物标志物联合应用于NEC诊断可能更有价值。

2.3. 三叶因子-3

三叶因子-3 (Trefoil factors-3, TFF-3)在肠道中表达，与维持粘膜屏障完整性、促进粘膜屏障修复及肠道炎症有关 [19] 。由于NEC存在肠道粘膜屏障的明显破坏，其病理特征包括炎症细胞浸润肠粘膜以及全身脓毒症等，TFF-3是NEC早期诊断的一种较有前景的生物标志物 [20] 。Coufal等发现NEC患儿尿TFF-3升高，其水平与肠道损伤程度相关，且TFF-3联合肠脂肪酸结合蛋白和血清淀粉样蛋白可以预测肠壁积气 [14] 。目前关于TFF-3早期诊断NEC的相关实验较少，仍需进一步研究证实其相关性。

2.4. 紧密连接蛋白

紧密连接蛋白(Claudins)在小肠中大量表达，由于NEC肠壁完整性的丧失，故其具有潜在的生物标志物效用 [21] 。Goldstein等发现NEC早产儿Claudin-2在肠道组织中表达降低，而尿液中含量增加 [22] 。Thuijls等对35名疑似NEC的婴儿进行研究，发现诊断为NEC的患儿尿claudin-3水平显著升高，当其临界值为801 INT时，诊断NEC的敏感性为71%，特异性为81% [23] 。目前相关研究样本量较小，需要更多研究来确定Claudins在NEC中的诊断价值。

2.5. 血清淀粉样蛋白

血清淀粉样蛋白(Serum amyloid-A protein, SAA)是一种急性期蛋白，在刺激性细胞因子诱导下由干细胞、内皮细胞等分泌，与免疫介导的炎症过程息息相关 [24] 。Reisinger等对62名可疑NEC患儿进行尿I-FABP、尿SAA及粪便钙卫蛋白测定，其中29名患儿最终确诊NEC，结果显示，尿SAA联合尿I-FABP不能提高NEC诊断的准确性 [25] 。随后他们再次对29名确诊NEC的患儿进行对比分析，发现重度NEC (手术性NEC、致死性NEC或Bell’s III期NEC)患儿尿SAA水平较轻度NEC (内科NEC、Bell’ I期或II期NEC)患儿显著升高，其临界值为34.4 ng/mL，敏感性为83%，特异性为83%，同时发现尿SAA与血清血小板计数联合使用时可以提高分辨轻重度NEC的准确性 [26] 。Stepan等认为NEC患儿尿液中SAA水平明显高于对照组，且能区分NEC严重程度，SAA与I-FABP、L-FABP联合可以预测门脉积气的发生或住院时长 [14] 。以上结果提示SAA可能不仅在早期无创性诊断中有一定价值，并且在随后的NEC管理中同样有用。

2.6. 粪便中肠道菌群谱

肠道微生物生态失调被认为与NEC发病密切相关 [27] 。研究认为NEC患儿的肠道微生物多样性降低 [28] 。然而，Feng等发现NEC组与对照组粪便中微生物群多样性无显著差异，这可能与样本量较小有关，同时他们发现NEC患儿粪便中丙酸杆菌较对照组更丰富，而乳酸杆菌相对丰度较低 [29] 。因此NEC患儿或许不仅微生物多样性发生变化，且菌群组成也可能有所差异。健康婴儿的肠道菌群主要由双歧杆菌组成 [30] ，而NEC患儿中双歧杆菌和乳酸杆菌的相对丰度降低 [31] ，大肠杆菌和克雷伯菌的相对丰度增加 [32] 。研究发现NEC发作前肠道菌群也有类似变化 [33] [34] 。Pammi等同样发现NEC患儿粪便微生物组在发病前变形菌门丰度增加，厚壁菌门和拟杆菌门丰度降低 [35] 。现有的研究发现NEC患儿在发病前肠道微生物出现变化，但由于肠道不同区域之间菌群组成存在差异，故其能否用于临床诊断尚需进一步研究分析。

2.7. 挥发性有机物

粪便挥发性有机物(volatile organic compounds, VOCs)是一种碳基气态化合物，来源于肠道细菌的营养物质发酵，被认为可以反映肠道微生物的组成、代谢活动以及微生物群与宿主之间的相互作用 [36] 。Hosfied等发现NEC小鼠模型粪便中VOCs与对照组有显著差别 [32] 。Catherine等认为NEC患儿在确诊NEC之前几天内粪便中VOCs较对照组数量减少，且样本中特异性酯种类减少 [37] 。De Meij等发现，在临床症状出现前2~3 d，NEC患儿的粪便VOCs谱就与对照组有显著差别，早期诊断NEC的敏感性为83%，特异性75% [38] 。多中心前瞻性研究表明NEC患儿粪便中VOCs在临床诊断最早4天前会发生改变 [39] 。然而，有研究发现粪便VOCs会因喂养方式及婴儿性别等不同而有所差别 [40] 。因此，可能需要更多研究来进一步评估VOCs与NEC的关系。

2.8. 肠碱性磷酸酶

肠碱性磷酸酶(intestinal Alkaline Phosphatase, IAP)是一种同型二聚体，主要在肠细胞顶膜上表达，具有抗炎和稳态作用 [41] 。作为肠道内表达的内源性蛋白质，IAP是无创性检测的理想选择。Richard等发现IAP过表达可能预示着NEC的发生风险增加，但并不显著(P = 0.12) [42] 。Heath等发现粪便中大量的IAP蛋白和低IAP酶活性与NEC诊断相关，可作为NEC的有效生物标志物，且IAP可以区分NEC和脓毒血症 [43] 。目前相关研究较少，需要更多试验来进一步确定IAP在诊断NEC中的价值。

2.9. S100A12

S100A2时一种胞质钙结合蛋白，在肠道炎症时由吞噬细胞激活释放，可能在先天免疫中有重要作用 [44] 。Dabritz等发现NEC患儿粪便中S100A12的含量较对照组显著升高，检测NEC的敏感性为70%，特异性68%，阳性和阴性预测值分别为37%和89% [45] 。这说明S100A2是一种有前途的诊断NEC生物标志物，需要更多研究来进一步验证其与NEC的关系。

2.10. 心率变异性

心率变异性(heart rate variability, HRV)是一种无创性检测自主神经调节水平的方法，可以根据心电图计算，通过心跳间隔值的快速傅里叶变换进行时域和频域分析 [3] [46] 。心率变异性的高频谱(high frequency spectrum of heart rate variability, HF-HRV)可以反映迷走神经张力，已被证实为胎儿和新生儿是否健康的标志物 [46] [47] [48] 。动物试验表明，迷走神经障碍会加重NEC小鼠肠上皮绒毛坏死，而NEC小鼠发病早期出现HF-HRV降低 [49] 。Tareq等发现，HRV在临床NEC诊断前2天出现下降，在诊断2天后恢复到正常水平，且HRV变化情况与临床严重程度显著相关 [47] 。临床发现Bell’s II期以上的NEC患儿在临床症状出现前4.5~7.5天即发生HF-HRV的降低，HF-HRV被认为是NEC进展的重要预测因子 [48] 。HF-HRV的主要优点包括其在NEC发病前非侵入性预测NEC、相对较低的成本以及使用现有软件易于分析，因此有潜力成为预测NEC的生物标志物。

2.11. 代谢组学

代谢组学是对小分子代谢物的分析，能反映机体对各种刺激的直接结果 [12] 。目前已有研究证实代谢组学在NEC诊断中的价值 [50] [51] 。研究表明NEC Bell’s II~III期患儿较I期患儿粪便中鞘磷脂显著升高，神经酰胺显著降低 [50] 。Thomaidou等研究发现NEC患儿尿液中有多种代谢物与对照组均有显著差异，且ROC曲线分析提示酪氨酸、精氨酸及核黄素在NEC诊断方面具有一定价值(AUC = 0.963, 95% CI [0.812~1.00]) [51] 。以上均提示代谢组学可以作为NEC早期诊断的生物标志物，但目前研究样本量较少，需要更多更大规模试验来验证代谢组学与NEC的关系。

除上述无创性生物标志物外，粪便脂质运载蛋白-2 [52] 、尿前列腺素E2 [53] 等也已被证实为预测NEC发展的很有前景的生物标志物。

3. 小结

近年关于NEC早期诊断的无创性生物标志物已有大量研究，这些研究对促进NEC临床治疗发展和发病机制的理解具有巨大作用，寻找可以早期诊断NEC的敏感和特异的生物标志物将会大幅降低NEC相关死亡率、提高NEC的预后。但目前尚未明确这些生物标志物的临界值，且其敏感性及特异性仍需进一步评估，因此未来需要更多中心、前瞻性研究来分析这些生物标志物的可重复性及有效性。

NOTES

^*通讯作者。