好氧反硝化细菌脱氮性能及其在污水处理中应用研究进展

Research Progress on Denitrification Performance of Aerobic Denitrifying Bacteria and Its Application in Wastewater Treatment

摘要: 好氧反硝化菌自从第一次被提出以来，就因为其挑战了厌氧反硝化理论，能够在好氧条件下发挥反硝化作用，实现了在一个反应器里硝化反硝化同时进行而受到了很多关注。本文较为系统的总结了近几年来从不同环境中筛选分离出的好氧反硝化菌，并从“协同呼吸理论”和“好氧反硝化酶作用”这两个方面深入探讨了好氧反硝化菌的反硝化作用机理。在此基础上，考察了各种环境因子对好氧反硝化菌脱氮效果的影响。包括碳源的种类，温度，溶氧，pH，盐度。最后对好氧反硝化菌在污水处理领域的应用前景进行分析，并利用好氧反硝化菌易于附着于生物膜表面，从而达到高效稳定运行的目的，为污水处理领域的实际应用研究提供理论依据。

Abstract: Since it was first proposed, aerobic denitrification bacteria have attracted much attention because they challenge the theory of anaerobic denitrification, can play the role of denitrification under aerobic conditions, and achieve simultaneous nitrification and denitrification in one reactor. This paper systematically summarizes the aerobic denitrifying bacteria isolated from different environments in recent years, and further discusses the denitrifying mechanism of aerobic denitrifying bacteria from two aspects: “cooperative respiration theory” and “aerobic denitrifying enzyme action”. On this basis, the effects of various environmental factors on the denitrification efficiency of aerobic denitrifying bacteria are investigated. Including the type of carbon source, temperature, dissolved oxygen, pH, salinity. Finally, the application prospect of aerobic denitrifying bacteria in the field of sewage treatment is analyzed, and the use of aerobic denitrifying bacteria is easy to attach to the surface of biofilm, so as to achieve the purpose of efficient and stable operation, and provide a theoretical basis for the practical application research in the field of sewage treatment.

1. 引言

水体中含氮化合物的过量富集，会引发各种环保与生态问题。比如过多的氮含量会引起水体富营养化，从而促使藻类和水草的过度生长，进而产生大量藻华。水中氮化合物含量过多是影响藻类生长的主要因素，张梦寒等对苏州市5批158件桶装水及1批6件源水进行藻类检测，结果藻类在桶装水检出率为5.7%，在源水中检出率为100% [1] 。另外，氮化合物的过量富集将造成水体中的氧被消耗殆尽，进而导致水域严重缺氧，从而影响水生生物的正常存活，最终对水生态系统形成不良影响。这严重违背了绿色发展的要求，日益威胁着生态安全和人类的生存 [2] 。所以，控制水体中含氮物质的过量富集已成为生态保护的必然要求。为了限制水体中含氮物质的过度富集，一个很重要的途径就是减少污水中氮的排放总量 [3] 。

传统的生物脱氮理论将生物脱氮过程分解为硝化与反硝化两个阶段。氨氮在好氧条件下被硝化细菌氧化为硝酸盐氮，这个过程一般是在自养条件下。最后在有机物提供碳源的条件下，经反硝化菌在厌氧或兼氧状态下将硝酸盐氮还原成N₂O和N₂等气态产物 [4] 。这两个部分对有机物和氧气(O₂)的要求完全相反。

反硝化作用是氮素生物地球化学循环过程的关键步骤。长期以来，人们一直以为，反硝化细菌只能在厌氧或者兼氧条件下发挥作用 [5] 。直到1980，研究者Meiberg首次发现了好氧反硝化细菌 [6] ，随后其他学者在此基础上首次分离出了一种好氧反硝化细菌——Thiosphaera pantotropha [7] 。大家对反硝化菌才有了更全新的认识：在好氧条件下，反硝化细菌也能发生硝氮还原现象。好氧反硝化技术挑战了传统的厌氧条件下只能进行反硝化的理论，并具有在一个曝气反应器内同时进行硝化和反硝化的独特优点，引起了人们的广泛关注 [8] 。同时，好氧反硝化菌的发现，进一步完善了反硝化理论学，并为开发新型生物脱氮技术奠定基础。本文对近年来国内外好氧反硝化微生物的分离、鉴定、脱氮机制、影响因素和应用前景等方面进行了较为系统的综述。

2. 好氧反硝化菌的发现及其分离

第一株具有好氧反硝化性能的细菌，是一九八零年Meiberg等人在对Hyphomicrobium X氧化甲胺/三甲胺进行研究的基础上发现的 [6] 。紧接其后，首株好氧反硝化菌Thiosphaera pantotropha被分离出来，该菌是Robertson等学者从废水脱硫和反硝化系统中筛选纯化后得到的 [7] 。为了对好氧反硝化菌的脱氮性能有一个更深入的了解，大量的研究人员开始致力于在不同环境中进行筛选和研究好氧反硝化菌株，如土壤、水库、湖泊、河流、海洋和污水处理厂等等。这些菌株大多数为革兰氏阴性细菌，常见种属为不动杆菌属、假单胞菌属、副球菌属、无色杆菌属、弧菌属、产碱杆菌属(Alcaligenes sp.)等等。

近40多年来，好氧反硝化已经得到了广泛的研究，目前已有大量的好氧反硝化细菌被报道。例如，郭焱等从景观湖底泥中筛选到一株好氧反硝化细菌，鉴定后确定该菌为假单胞菌J-5。该菌株具有较好的底物适应性，在多种不同碳源和不同氮源条件下都有很多的脱氮性能。通过研究发现其最佳的培养条件为：碳源为丁二酸钠，硝酸钾作为氮源，pH = 10 [9] 。李茜等从稻虾养殖塘污水污泥中分离得到一株盖氏假单胞菌YZWF2207，其在水产养殖污水处理中表现出了强大的反硝化力和竞争性，是一种极具应用潜力的高效脱氮菌 [10] 。夏平等通过富集、纯化从微污染废水处理生物膜中分离得到一株草螺菌属菌XDT-1，该菌株具有好氧反硝化、耐低温、低 pH等优点，对提升城市污水脱氮效能具有重要的现实意义 [11] 。张志昊等在实验室内运行稳定的生物滤池中筛出一株伯克氏菌(Burkholderia sp.) ZH8，其具有好氧反硝化作用，脱氮除磷能力都可达到95%以上 [12] 。

3. 好氧反硝化菌脱氮机理研究

好氧反硝化是指在好氧条件下进行的一种反硝化过程，不同于以往认为只有在厌氧或缺氧状态下才能实现脱氮的传统观点。到目前为止，关于好氧反硝化脱氮的反应机制仍有分歧，对其机理的讨论也不够完善，至今仍处于探索性阶段。但被大部分研究者所接受的两个好氧反硝化机理分别是协同呼吸理论和好氧反硝化酶作用。

3.1. 协同呼吸理论

协同呼吸理论认为，反硝化微生物既能向氧转移电子，又能向硝酸根转移电子。也就是说，碳源比如乙酸钠等作为电子供体，而电子受体既是氧气又是硝酸盐。由于O₂比 $$ 具有更高的电子亲和力，所以在好氧反硝化菌对外界能量需求比较低的情况下，更倾向于把O₂当作电子受体；而在好氧反硝化菌对外界能量需求比较高的情况下，作为电子受体的 $N{O}_3^{-}\text{-}N$ 竞争能力增强，电子转移到 $N{O}_3^{-}\text{-}N$ 的比例增加。虽然NO₃⁻-N对电子的竞争弱于O₂，但 $N{O}_3^{-}\text{-}N$ 仍能与O₂参与微生物代谢，即发生好氧反硝化作用。

在常规传统脱氮过程中，细胞色素c (Cyt c)与细胞色素aa3 (Cyt aa3)间的电子传递受到限制，所以导致电子难以向O₂传输。在此基础上，我们提出了协同呼吸理论，这就很好的解释了之前电子传输的“瓶颈现象”。即电子能同时向 $N{O}_3^{-}\text{-}N$ 和O₂转移，也就是说，在好氧条件下可以发生反硝化反应 [7] 。

3.2. 好氧反硝化酶作用

随着科技水平的提高，好氧反硝化有关酶学的研究逐渐成为近几年来的一个热门话题。

据酶理论，一共有四种酶(NAR、NIR、NOR和NOS)在好氧反硝化中起关键作用。好氧反硝化中的硝酸盐还原酶NAR首先催化硝酸盐为亚硝酸盐，再通过亚硝酸盐还原酶NIR将亚硝酸盐转换NO，随后NO在一氧化氮还原酶NOR的作用下转换成N₂O，最终通过氧化二氮还原酶NOS将氧化二氮还原成氮气 [13] 。

Jetten等学者发现存在两种不同的NAR，即膜内硝酸盐还原酶(M-NAR)和质周硝酸盐还原酶(P-NAR) [14] 。与细胞膜结合的酶是M-NAR，但P-NAR位于细胞壁和细胞膜之间。M-NAR酶仅在缺氧和厌氧条件下表达，而在有氧条件下并不起作用。相比之下，P-NAR酶可以在有氧和厌氧环境下产生，并且在高DO浓度下都是可行的，这表明P-NAR在有氧条件下更好地表达 [15] 。好氧反硝化细菌由于具有独特的M-NAR和P-NAR，可同步实现O₂与 $N{O}_3^{-}\text{-}N$ 的还原，因此好氧环境不再是约束条件。

4. 好氧反硝化菌反硝化作用的影响因素

好氧反硝化菌的生长和脱氮性能受到多种因素的影响，如碳源类型、碳氮比、温度、溶解氧、pH、盐度、初始氮浓度、抗生素、磁场、微生物群落等。本文综述了碳源、温度、溶解氧、pH值和盐度等对菌株好氧反硝化特性的影响。

4.1. 碳源

不同于硝化作用以无机碳作为碳的主要来源，好氧反硝化菌主要以有机碳为碳源。自养生长的硝化菌一般发育缓慢、硝化效率低，而好氧反硝化菌一般为异养菌，生长速度比较快。碳源是影响好氧反硝化菌生长性能和脱氮性能的重要因素 [16] 。

目前研究表明，好氧反硝化细菌可以利用的有机碳源有：柠檬酸钠，葡萄糖，乙酸钠，蔗糖，琥珀酸，琥珀酸钠，甲醇，乙醇等。少数好氧反硝化菌还可以利用难以分解的有机物质作为碳源。另外，不同的菌种对不同的有机基质表现出广泛的偏好。

例如，赵洋等在研究不同碳源对菌株Pseudomonas stutzeri DZ11的好氧反硝化性能的影响时，发现当培养基中唯一碳源为柠檬酸钠时，菌株有着最高生长量且综合脱氮性能最好 [17] 。Chen等发现Diaphorobacter sp. PD-7在85 h内完全降解了苯酚(1400 mg·L⁻¹)，并在65 h内去除了大约91%的 $N{O}_3^{-}\text{-}N$ (164.7 mg·L⁻¹) [18] 。Wu等发现了一种新分离的好氧反硝化细菌calcoaceticus TY1，脱氮效果最佳的碳源为柠檬酸钠 [19] 。

4.2. 温度

好氧反硝化菌一般在25℃~37℃条件下生长，这也是细菌生长的最适温度。如果温度低于10℃，好氧反硝化细菌的反硝化性能会降低。这是因为温度会对酶活性产生影响 [20] 。如果温度太高或太低，反硝化作用都可能被抑制 [16] 。好氧反硝化细菌的温度敏感性已经被许多研究者在实验中得到了很好的验证 [21] 。

一般来说，几乎所有已知的好氧反硝化反应都发生在中温条件下(20℃~40℃)。例如，Su等、研究表明Raoultella sp. R11在30℃时具有良好的反硝化能力，并能完全降解 [22] 。然而，对于对温度比较敏感的好氧反硝化菌来说，也有一些特殊情况。有一些好氧反硝化菌能够在极寒或者极热条件下生存。例如，Zhao等人从猪场废水中分离出一株菌株，鉴定为Acinetobacter sp. TAC-1。在低温条件下(5℃)，该菌株脱氮性能依旧良好，硝氮(400 mg·L⁻¹)的去除率达到93.3% [23] 。Yao等人新分离得到了一株异养型硝化–好氧反硝化细菌，经表型和系统发育分析鉴定为不动杆菌属。该菌株具有良好的低温耐受性，其最适温度为20℃，存活温度为4℃。在低温、纯好氧条件下，铵盐、亚硝酸盐和硝酸盐的去除效果较好，且中间产物积累较少 [24] 。Wei等分离出一株新型耐寒菌株根瘤菌sp. WS7，其在15℃条件下脱氮效率显著， $N{O}_3^{-}\text{-}N$ 去除率为99.98%，在污水冷处理中具有很大的应用可行性 [25] 。Lin等建立了一个高温(50℃)异养硝化–好氧反硝化(HNAD)生物膜系统。结果表明，HNAD工艺具有良好的耐高温性能，高温系统在50℃时表现出良好的脱氮和COD能力。在这个系统里氨氧化主要由异养硝化作用进行，而缺氧和好氧途径协同作用于反硝化作用。并通过基因组学研究揭示了好氧反硝化菌在高温下的微生物机制，高通量测序结果显示，在50℃条件下，反硝化菌占据52.88% [26] 。

这些发现对北方地区低温含氮废水和高温工业废水的实际工程处理具有重要意义，为好氧反硝化菌应用于低温或高温等极端环境下奠定了理论基础。

4.3. 溶解氧

如果从电子转移的角度来看，在好氧反硝化过程中， $N{O}_3^{-}\text{-}N$ 和O₂都可以成为电子受体， $N{O}_3^{-}\text{-}N$ 和O₂的共存必然会竞争电子。如果从热力学的角度来看，当O₂被好氧反硝化菌用作电子受体时，好氧反硝化菌获得的能量远比 $N{O}_3^{-}\text{-}N$ 作为电子受体的多，因此好氧反硝化菌更容易利用O₂。好氧反硝化受DO的影响，其作用大小随微生物类型而异。

目前，国内外学者通过对振动筛旋转速度进行调控，从而实现对溶解氧的有效调控 [27] 。在一项研究DO对施氏假单胞菌T13好氧反硝化作用的研究中，通过改变摇动速度来控制DO浓度。振动速度为120、150和160 rpm分别相当于4.7、6.5和7.2 mg·L⁻¹的DO。当振动速度保持在160 rpm以下时，观察到显著的 $N{O}_3^{-}\text{-}N$ 去除效率 [28] 。当振动转速低于120 rpm (4.37 mg·L⁻¹)时， $N{O}_3^{-}\text{-}N$ 几乎100%被排出 [29] 。

一般来说，好氧反硝化菌较高的脱氮能力仅发生在一定的DO浓度区间内，如果不在这个区间内，则会影响反硝化效率，并且该DO浓度范围因生物种类的不同而不同 [18] 。但是有些好氧反硝化菌随着DO浓度的增加其反硝化性能会下降。如果DO浓度超过一定限度，则DO浓度的增加不会影响ADB的脱氮性能，该浓度称为DO阈值。有些好氧反硝化菌比较少见，能够在高浓度DO发挥反硝化作用。

4.4. pH

对于好氧反硝化过程来说，pH是影响其速率的重要因素之一 [30] 。一般来说，酸性条件(pH < 5)和碱性条件(pH > 10)都会影响好氧反硝化菌的生长。张宇红等筛选得到一株新型高效好氧反硝化细菌–葡萄球菌属(Staphylococcus) SY-D-22，发现其最佳反硝化条件为pH 8.18 [31] 。Huang从海水养殖水中分离出的一株细菌(Bacillus litoralis N31)在pH值为7.5至8.5之间表现出有效的反硝化作用 [32] 。Su等发现Raoultella sp. R11具有明显的好氧反硝化，通过napA基因扩增确定了菌株R11的脱氮机理。响应面法(RSM)分析结果表明，菌株的硝酸盐去除率最高可达96.06%，最佳pH为6.65 [33] 。

有趣的是，一些研究表明某些好氧反硝化菌能够在好氧反硝化期间自我调节pH。比如Serratia marcescens W5就能够自主地将pH从10.0降至7.2，以满足理想最佳生长条件 [34] 。

4.5. 盐度

好氧反硝化菌脱氮效果也受盐度的影响。高盐引起的高渗透压会使微生物细胞脱水，并阻碍其与外界环境间的物质转运，从而影响其正常代谢，甚至引起细胞崩解及酶活下降 [31] 。

但是，对于一些嗜盐细菌来说，一定的盐度水平反而促进了反硝化作用。例如，Duan等学者从海洋沉积物中分离到一种嗜盐异养硝化–好氧反硝化细菌diabolicus弧菌SF16。研究发现在1%~5%的盐度下，菌株SF16对 $N{H}_4^{+}\text{-}N$ 的去除效果不错。但在不添加NaCl时几乎不去除 $N{H}_4^{+}\text{-}N$ 。说明NaCl对菌株SF16的酶活性至关重要 [35] 。

Cui等研究分离到了一株嗜盐好氧反硝化细菌Exiguobacterium mexicanum SND-01，该菌株具有轻微的嗜盐性，可在0%~9% (w/v)盐度下存活 [36] 。

目前对嗜盐微生物耐盐机制的分析主要包括：钾吸收和钠排泄机制；相容溶质在细胞内的积累；以及生产嗜盐酶 [37] [38] 。具体机理有待进一步研究。

5. 好氧反硝化菌在污水处理中的应用潜能

早期的研究主要集中在分离鉴定纯的好氧反硝化细菌和分析对其脱氮性能有影响的环境因素。为了更好地发挥其在废水处理领域的重要作用，近几年来研究者们开始将好氧反硝化细菌引进到污水处理设备中。

但是好氧反硝化细菌由于不能在长期的竞争中占据主导地位成为优势物种而最终被淘汰，因此无法将其直接投入到污水处理反应器中。另外，长时间运行后，好氧反硝化细菌数量及相对丰度会下降。这些限制使得好氧反硝化的脱氮性能非常不稳定，这是制约该技术规模化应用的一个重要因素。生物膜反应器通过保留附着在自由移动或固定载体材料上的生物膜的微生物细胞来提供高浓度的活性生物量 [39] 。好氧反硝化菌可以很容易地挂在生物膜上以实现细菌固定化。

Tian等将好氧反硝化细菌PCN-1固定在聚氨酯生物载体上，在中试氧化沟中进行了生物强化处理，效果良好。微生物群落分析表明，生物强化促进了活性污泥与生物载体之间细菌种群的共生关系。反硝化菌在生物载体上占主导地位，具有众所周知的N₂O还原能力 [40] 。Hong等为了提高SBBR处理富氮废水的效率，对门多萨假单胞菌IHB602，格里根甲基杆菌属DC-1和施氏假单胞菌IHB618这3种具有强自聚集和高脱氮双重能力的好氧反硝化菌进行了研究。结果表明，3株菌种共存时的共聚集优于单独生长的1株或2株。采用最佳共聚集菌对试验反应器(SBBRT)进行生物强化，其生物膜形成时间比未接种的对照反应器(SBBR_C)短。不同进水氨氮负荷(150、200和300 mg·L⁻¹)下，氨氮和硝氮的平均去除率均高于SBBR_C，亚硝酸盐氮积累量低于SBBR_C。微生物群落结构分析表明，共聚集菌可以在生物反应器中成功定植，并且对高浓度氮具有很强的耐受性，有助于高效去除无机氮和形成生物膜 [41] 。Chen等在MBBR中接种好氧反硝化菌处理家禽养殖废水，结果表明，不同载体类型对不同C/N比下的反硝化效果有显著影响，聚乙烯醇(PVA)凝胶载体比卡尔德斯载体更适合好氧反硝化菌的生长。此外，微生物学分析表明，以PVA凝胶为载体的MBBR有利于少营养菌和异养硝化-好氧反硝化菌的生长，在C/N比为6时，相对丰度最高，为16.37% [42] 。

依靠好氧反硝化菌的生物膜反应器在目前的实验室中试以及部分中试中均达到了预期的氮处理效果。但是需要注意的是，由于生物膜堵塞、填料成本高、抗冲击负荷能力弱等原因，好氧反硝化菌在实际中的应用依然是目前国内外研究的热点和难点。

6. 结论与前景展望

1) 目前的研究表明，好氧反硝化菌在环境中广泛存在。越来越多的学者在不同环境中筛选分离出各种好氧反硝化菌。比如土壤、水库、湖泊、河流、海洋和污水处理厂等等。

2) 目前对好氧反硝化菌的作用机制被广泛认可的有两种解释，即协同呼吸理论和好氧反硝化酶作用。然而，迄今为止，好氧反硝化菌的作用机制还停留在理论解释阶段，具体的作用机制尚不清楚，学术界还缺乏一个被广泛接受的答案。

3) 好氧反硝化菌的生长受碳源、温度、溶解氧、pH、盐度等多种因素的影响。一般来说，碳源类型不同，菌的反硝化能力也不同。温度通过影响好氧反硝化菌的酶系来影响其脱氮效率。大多数好氧反硝化菌是在中温(20℃~40℃)中发现的，但最近也发现了耐高温或耐低温好氧反硝化菌。DO对好氧反硝化菌的影响可分为三种情况，大多数好氧反硝化菌仅在一定的DO浓度范围内表现出良好的脱氮性能。pH对好氧反硝化菌有极其重要的影响，大部分好氧反硝化菌只能在最适pH (pH在7.5~8.5之间)下旺盛生长，也能耐受极端pH，甚至能自行调节pH达到最佳生长条件。

4) 近几年来，研究者开始利用生物强化技术将好氧反硝化菌固定在生物膜上再投放到污水处理反应器中。好氧反硝化菌既能在好氧条件下去除污水中的氮，又能实现同步硝化反硝化，是具有很大发展潜力的新技术。然而，相关研究尚处于实验室模拟污水的小型试验阶段，距离真正的污水处理及小尺度工程应用还有很长一段距离。