摘要: 背景：随着我国经济水平的持续发展和人口老龄化的不断加重，T2DM和衰弱的发病率持续增加。目的：探究2型糖尿病与衰弱之间的因果关系，为糖尿病与衰弱发病风险关联提供遗传学证据支持。方法：研究采用MR-Egger回归法(MR-Egger regression)、加权中位数法(Weighted median, WME)、逆方差加权法(Inverse variance weighted, IVW)、简单估计法(Simple mode)、加权模型法及逆方差加权随机效应法(Inverse variance weighted random effects) 6种回归模型对2型糖尿病与衰弱的因果关系进行孟德尔随机化分析。结果：IVW模型显示糖尿病为衰弱的危险因素，IVW随机效应模型则显示2型糖尿病有统计学意义的影响因素；MR-Egger回归截距项
P值均>0.05，即筛选出的SNP不存在基因多效性，因此孟德尔随机化在本研究中为因果推断的有效方法；异质性检验结果
P值均<0.001，故应重点关注随机效应IVW模型。结论：利用两样本孟德尔随机化方法排除混杂因素和反向因果关联后，得到无偏估计的结果，据此可以确定2型糖尿病与衰弱之间存在因果关系。
Abstract:
Background: With the continuous development of China’s economic level and the aging of the population, the incidence of T2DM and frailty continues to increase. Objective: To explore the causal relationship between type 2 diabetes and frailty and provide genetic evidence for the risk association between diabetes and frailty. Methods: This study employed six regression models, namely MR-Egger regression, weighted median (WME), inverse variance weighted (IVW), simple mode, weighted model, and inverse variance weighted random effects, to conduct Mendelian randomization analysis on the causal relationship between type 2 diabetes and frailty. Results: The IVW model showed that diabetes is a risk factor for frailty, while the IVW random effects model demonstrated a statistically significant impact of type 2 diabetes. The P-values for the intercept terms in the MR-Egger regression were all more than 0.05, indicating no genetic pleiotropy for the selected SNPs, thus confirming that Mendelian randomization is an effective method for causal inference in this study. The P-values for heterogeneity tests were all <0.001, highlighting the importance of the random effects IVW model. Conclusion: By employing the two-sample Mendelian randomization method to account for confounding factors and reverse causality, unbiased estimates were obtained, supporting the existence of a causal relationship between type 2 diabetes and frailty.
1. 引言
2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus, T2DM)是一种慢性代谢性疾病，主要特征是胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能减退，导致血糖升高。T2DM占糖尿病患者的大多数，多发于中老年人，其病程长，初期可能没有任何明显症状，但如果长期不加控制，会导致各种并发症，如心血管疾病 [1] 、神经病变 [2] 、视网膜病变 [3] 、肾病 [4] 等，严重者甚至会威胁生命。据中国T2DM人群流行病学调查结果显示，截至2020年，我国成年人T2DM患病率已经达到10.9%，约有1.17亿人 [5] 。预计到2030年，我国T2DM患者数量将增至2亿人以上，居全球之首。
衰弱(Frailty)是指由于多种疾病或生理状态的影响 [6] ，导致机体的氧化抗氧化平衡失衡，从而引发代谢和营养紊乱，促使机体器官和功能逐渐减退，体力、精神和健康状况逐渐下降的一种临床表现 [7] 。据世界卫生组织(World Health Organization, WHO)数据显示，全球约有超过6000万65岁及以上的人患有衰弱 [8] 。
既往研究表明，血糖水平升高是导致T2DM患者出现衰弱症状的一个重要原因 [9] 。孟德尔随机化(Mendelian randomization, MR)是一种重要的因果推断方法 [10] ，利用遗传变异位点，如单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)，作为工具变量(instrumental variable, IV)，分别研究IV与暴露因素、结局间的关联，以推断暴露因素与结局间的因果关系。本研究将应用MR思想，将多个SNP整合为IV，以探讨T2DM与衰弱之间的因果关系。
2. 数据与方法
2.1. 数据来源
本研究利用T2DM作为暴露因素，与T2DM显著相关的SNP作为工具变量， 衰弱作为结局变量，使用两样本MR分析的方法进行因果关联分析。T2DM患者样本来自于英国生物样本库(UKBiobank)的全基因组关联研究(genome wide association study, GWAS)，研究对象为欧洲人种，包括22,340名T2DM患者和439,238名非T2DM患者，共包含9,851,867个SNP。衰弱患者样本来自于2021年发表于Aging Cell上的关于衰弱指数和大脑通路的GWAS研究 [9] ，可在NHGRI-EBI数据库下载。该研究队列共包括175,226人，均为欧洲种族，含7,589,717个SNP。
我们从T2DM SNP中筛选出与T2DM有关的风险SNP，包括与T2DM关联性的P值小于5 × 10−8、连锁不平衡(r2 < 0.001或遗传距离 ≤ 10,000 kb)以及最小等位基因频率大于0.01的SNP。随后，我们提取了这些SNP的编号、有效等位基因、有效等位基因频率，以及它们与T2DM和衰弱的效应值、标准误和P值。
2.2. 统计学方法
2.2.1. MR的三个基本假设
MR要求满足以下三个基本假设(图1)：
1) 工具变量G与中间变量X之间存在稳健的相关关系。
2) 工具变量G与混杂因素C相互独立。
3) 工具变量G仅通过中间变量X对结局Y产生作用，即不存在多效性。
Figure 1. Directed acyclic graph of instrumental variables
图1. 工具变量有向无环示意图
2.2.2. MR因果关联计算方法
在本研究中所用的MR方法主要包括了：(1) MR-Egger回归法：该方法使用加权线性回归来估计SNP-暴露对SNP-结果的影响。回归截距检验多效性偏差，较小的截距表示较少的基因多效性。(2) 加权中位数法(WME)：该方法通过计算个体SNP比率估计的经验分布函数的中位数来估计效应。(3) 逆方差加权法(IVW)：该方法通过使用一阶权重对个体变异的比率估计进行IVW平均值，估计效应。它假定所有SNP都是有效的工具，并可与固定效应或随机效应一起使用。(4) 简单估计法：该方法使用SNP-结果对SNP-暴露的简单线性回归来估计效应。(5) 加权模型法：该方法类似于IVW方法，但使用效应估计的逆方差作为权重。(6) 逆方差加权随机效应法：若通过逆方差加权法分析结果显示工具变量存在明显的异致性，则使用逆方差加权随机效应法。
2.2.3. 敏感性分析
为了检测工具变量的平均多效性，可以使用MR-Egger方法 [11] 。如果回归方程的截距为0，或者截距项的P值不显著，则可以判定不存在偏倚。Leave-one-out法的原理是逐一剔除各个SNP，计算剩余SNP的合并效应，以此来判断是否存在某个工具变量的主效作用导致暴露因素与结局变量之间的因果关联。
2.3. 分析软件
所有分析均采用双尾显著性阈值0.05。我们使用R软件的4.2.2版本进行分析，并采用TwoSampleMR软件包进行MR分析。
3. 结果
3.1. SNP信息
本研究所使用的样本SNP信息如表1所示，经过两组匹配后得到68个SNP。在这些SNP中，有效等位基因与T2DM的β值范围为−0.0205539到0.0146745，其与衰弱的最大|β|值为0.0492。此外，这68个SNP的F统计量均大于10，表明该整合工具变量不存在弱工具变量偏倚。
Table 1. The effect sizes of various SNP on T2DM and frailty
表1. 各SNP对T2DM和衰弱的效应值
3.2. SNP间异质性检验
通过Cochran Q方法进行SNP间的异质性检验，结果显示SNP间存在较显著的异质性(P < 0.001, Q = 181.028)。
3.3. 敏感性分析
通过MR-Egger回归法进行敏感性分析，结果显示截距值小于0.001，且P值不具有统计学意义(P = 0.799)，表明MR分析结果未受到多效性影响。
3.4. T2DM与衰弱的MR分析
分析结果如图2所示，加权中位数法、逆方差加权法及加权模型法均提示结果具有统计学意义。虽然异致性检验提示SNP间存在明显的异致性，但逆方差加权随机效应法同样提示有统计学意义的结果(P < 0.001, OR = 2.49, 95% CI: 1.78~3.48)，即在整体人群中，T2DM与衰弱之间存在正向的因果关系，因此我们的结论是可靠的。图3所展示为T2DM与衰弱的散点图。
Figure 2. Forest plot showing the results of Mendelian randomization analysis
图2. 森林图所示孟德尔随机化分析结果
Figure 3. Scatter plot of T2DM and frailty
图3. T2DM与衰弱的散点图
4. 讨论
随着我国经济水平的持续发展和人口老龄化的不断加重，T2DM和衰弱的发病率持续增加。目前的观点认为，衰弱是T2DM的一种新型并发症，T2DM与衰弱存在相互作用，国内外许多学者通过流行病学研究证实了这一观点。Kong等 [12] 的研究表明，中国社区老年T2DM患者合并衰弱及衰弱前期的总体患病率分别为20.1%和49.1%。与非T2DM老年人相比，老年T2DM患者更容易发生衰弱(OR = 1.61, 95% CI: 1.47~1.77, P < 0.001)。北京老龄化纵向研究II (BLSA-II) [13] 的数据显示，老年T2DM患者的衰弱患病率和发病率明显高于非T2DM患者(分别为19.32%比11.92%和12.32%比7.04%)。国外的一项调查 [14] 发现，社区60岁以上T2DM患者的衰弱患病率约为10%至25%。
传统的观察性流行病学研究方法通常容易受到反向因果关联和潜在混杂因素的影响，从而削弱了研究结果对于病因假设的支持。相比之下，MR分析则可以更好地用于研究因果关系效应，特别是在研究两种因素之间的因果关系时。本研究利用大规模的GWAS汇总数据，采用两样本MR分析方法研究了不同性别中的T2DM对于衰弱的影响。在遗传角度证实人群中T2DM会增加衰弱的发生风险。
T2DM导致衰弱可能与多种因素相关，例如HbA1c、血清白蛋白、胱抑素C、体质量、营养不良、共病等 [15] 。在衰弱的情况下，低血糖所造成的相关风险增加，所以建议更高的HbA1c目标 [16] 。老年人肠道吸收功能差、食欲下降，易导致摄入的蛋白质减少，肌肉质量下降明显，会功能障碍 [17] 。血清白蛋白水平与老年人体质衰弱呈负相关，低白蛋白血症也可由炎症和慢性疾病引起 [18] ，这些因素可能是独立的，也可能存在协同作用。胱抑素C可以通过抑制内源性或外源性半胱氨酸肽酶(包括肌肉细胞)来调节衰老细胞免疫系统影响衰弱程度 [19] 。共病的存在使得老年人同时服用多种药物，导致药物不良反应增加。在衰弱方面，老年女性的衰弱患病率高于男性，这可能与老年女性肌肉质量、身体机能下降更多有关 [20] 。此外，不良的饮食和运动习惯也是影响衰弱的重要原因之一。研究表明，T2DM患者采用合理的饮食方式和早期生活方式干预可有效预防衰弱进展 [21] 。与并发急性心脑血管事件、严重代谢紊乱等相比，衰弱是增加老年T2DM患者死亡和残疾风险的非传统因素。衰弱还可能导致许多其他临床不良结局，如跌倒、骨折、移动能力下降、残疾、脑卒中和痴呆等 [22] 。因此，T2DM与衰弱的发病率高，危害大，通过识别和预防造成T2DM合并衰弱的潜在危险因素，依据衰弱级别合理用药，提供综合支持照护，营养方面如进行合理膳食、补充优质蛋白质，戒烟限酒；运动方面可以进行适度锻炼，抗阻训练联合有氧运动可以改善患者衰弱 [7] ，其他方面如规律的生活起居，保持良好的健康态度，有效的检测血糖水平，均可以有效延缓T2DM患者的病程，减小合并症危害，降低住院率和死亡率 [23] 。
虽然本研究使用了T2DM显著相关的SNPs作为工具变量，并利用MR方法对T2D与衰弱进行因果关联，但该研究也存在一定局限性。首先，两样本MR分析使用的是GWAS的汇总数据，缺乏个体数据，无法解释暴露因素和疾病结局之间的非线性关系。其次，本研究缺乏详细的分组数据，无法探索T2DM前期以及不同年龄段的T2DM患者是否与衰弱也存在因果关联。此外，样本库数据来自于欧洲人群，缺乏我国人口的样本资料。
5. 结论
总之，本研究利用T2DM显著相关的SNPs作为工具变量，利用MR方法对T2DM与衰弱进行因果关联，在没有偏倚的情况下，结果表明T2DM会增加衰弱的发病风险。这也揭示着该类群体应该建立正确的饮食习惯及生活方式，积极监测控制血糖，预防T2DM及其并发症。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。