镉和汞对毛蚶心脏组织的影响

Effects of Cd²⁺ and Hg²⁺ on Cardiac Tissue Pathology in Scapharca subcrenata

摘要: 健康的心脏机能对动物的健康甚至生存至关重要，虽然目前研究主要集中在脊椎动物，但关于双壳类软体动物心脏的毒性影响，尚存认知空白。为探究Cd²⁺、Hg²⁺对毛蚶心脏组织结构的影响，通过设定不同浓度、时间及金属的单一或联合暴露，构建了对照组与实验组，实验周期为48小时。应用组织学方法本研究详细观察了Cd²⁺和Hg²⁺对毛蚶心脏组织结构的影响。研究结果显示，Cd²⁺和Hg²⁺可引起毛蚶心肌损伤，如心肌纤维断裂、细胞水肿或坏死，细胞间隙增大；以及纤维排列紊乱和纤维化等病理现象。随重金属浓度增加，病理程度加重。此外，两种金属对毛蚶生理的毒性作用呈现出拮抗关系。本研究为理解重金属对毛蚶的毒性机制提供了重要基础。

Abstract: Healthy heart function is crucial to the health and even survival of animals. Although the current research mainly focuses on vertebrates, there is still a cognitive gap about the toxic effects of bivalve mollusks on the heart. In order to explore the effects of Cd²⁺ and Hg²⁺ on the cardiac tissue structure of Scapharca subcrenata, the control group and the experimental group were constructed by setting different concentrations, time and single or combined exposure of metals. The experimental period was 48 hours. The effects of Cd²⁺ and Hg²⁺ on the cardiac structure of Scapharca subcrenata were observed in detail by histological method. The results showed that Cd²⁺ and Hg²⁺ could cause myocardial injury in Scapharca subcrenata, including myocardial fiber breakage, cell edema or necrosis, and pathological phenomena such as fiber arrangement disorder and fibrosis. With the increase of heavy metal concentration, the pathological degree was serious. In addition, the toxic effects of the two metals on the physiology of Scapharca subcrenata showed an antagonistic relationship. This study provides an important basis for understanding the toxic mechanism of heavy metals on Scapharca subcrenata.

1. 引言

毛蚶(Scapharca subcrenata)，通称毛蛤，隶属于软体动物门(Mollusca)、瓣鳃纲(Lamellibranchia)、蚶目(Arcoida)、蚶科(Arcidae)、毛蚶属(Scapharca)，是一种广温广盐的物种，以埋栖生活为主，环境适应性强，自然分布于近岸及河口地区的泥沙质底质中[1]。作为一种重要的海产经济贝类，毛蚶以其鲜美的味道、高营养价值及药用价值，市场需求持续旺盛。然而，由于过度捕捞以及海洋环境污染和破坏的影响，其自然资源储量呈现逐年下降的趋势[2]。

随着沿海工业的快速发展，近岸海域的重金属镉(Cd)污染问题日益严重，贝类体内重金属的富集对其食用安全构成较大影响，引起公众日益关注[3]。以离子形式存在于水体中的重金属易于通过附着于有机或无机颗粒物的方式进入贝类体内并进行富集[4]。重金属污染的扩散性强、难以降解、可通过食物链传递的特性，特别是在海洋贝类中的高富集浓度，不仅对海洋贝类的繁殖发育和生理活动构成不利影响，也威胁到海洋生态环境及人类食品安全等多个方面[5]。例如，汞(Hg)作为一种重金属，具有极大的危害性，不仅会引起生物体的急性毒性效应，还可在生物体内积累并沿食物链转移，对海洋生态系统造成难以逆转的损害[6] [7]。毛蚶作为双壳贝类，由于其滤食性及活动性较差的特征，表现出较高的重金属富集能力。探究毛蚶与重金属污染之间的相互作用关系，具有重大意义。

相较于脊椎动物，重金属暴露对水生无脊椎动物，如毛蚶，可能引起的组织学、生化和生理改变更为显著[8] [9] [10]。由于无脊椎动物循环系统的开放性以及心脏内缺乏内皮细胞，其心脏可能更易受到污染物的影响[11]-[18]。先前研究已证明重金属对毛蚶的鳃、内脏团、肾脏等器官有显著生理影响，但对心脏这一重要器官的研究相对较少[19] [20] [21]。心肌组织的完整性是其正常功能发挥的前提[22]。鉴于心脏是对重金属毒性反应最为敏感且易受损的器官之一，心脏组织形态的变化可作为评估重金属毒性影响的重要标准。通过深入研究毛蚶心脏组织在重金属胁迫下的响应，本研究的目的在于构建一个更为全面和系统的重金属影响下毛蚶心脏相关功能的框架，为理解重金属污染对双壳贝类心脏功能的毒性机制提供了科学依据。

2. 材料与方法

2.1. 试验毛蚶

本实验所用到的毛蚶主要来源于天津市滨海新区的大神堂海域，选择健康，个大且大小(壳长平均42 ± 3 mm，壳宽平均24 ± 3 mm)一致，色泽正常的毛蚶，清洗干净后放入盛有海水的水槽中，运至天津农学院，在实验室进行7天的暂养。暂养期间每日全量更换海水，持续曝气，暂养温度20℃左右，盐度33，pH 8.1。

2.2. 重金属试剂

实验采用分析纯的CdCl₂、HgCl₂ (国药集团，中国)，用双蒸水配成分别含Cd²⁺、Hg²⁺为200 mg/L和4000 mg/L的母液，实验时稀释成所需要的浓度。

2.3. 实验方法

2.3.1. 重金属胁迫

在5 L的蓝色养殖箱内放入盐度为29、体积为4.5 L的配制海水，随机投放经过24 h饥饿处理、健康活泼的毛蚶6只，采用静水养殖方式，连续充气。实验期间不投铒。实验浓度根据预实验结果进行设置，每种重金属设置2个浓度处理组，每组两个平行样，一组不进行重金属添加作为空白对照组，进行48 h的Cd²⁺和Hg²⁺单一和联合急性毒性实验。如表1所示，试验设置了1个对照组和6个实验组，实验组浓度分别为5 mg/L Cd²⁺、5 mg/L Hg²⁺、5 mg/L Cd²⁺ + Hg²⁺、20 mg/L Cd²⁺、20 mg/L Hg²⁺、20 mg/L Cd²⁺ + Hg²⁺。在实验开始前，将配好浓度的重金属倒入海水中，通入氧气，将毛蚶放入，在网箱上方盖上塑料膜。

Table 1. Experimental setup for Cd²⁺ and Hg²⁺ stress treatments

表1. Cd²⁺和Hg²⁺胁迫实验组设置

实验组	浓度	24 h	48 h
1	5 mg/L Cd^2+	6只毛蚶	6只毛蚶
2	5 mg/L Hg^2+	6只毛蚶	6只毛蚶
3	5 mg/L Cd^2+ + Hg^2+	6只毛蚶	6只毛蚶
4	20 mg/L Cd^2+	6只毛蚶	6只毛蚶
5 6	20 mg/L Hg^2+ 20 mg/L Cd^2+ + Hg^2+	6只毛蚶 6只毛蚶	6只毛蚶 6只毛蚶

2.3.2. 取材、固定、切片、染色

于24 h和48 h观察并取出毛蚶解剖心脏(表1)。解剖步骤：用解剖刀背敲碎一侧贝壳，切断前、后闭壳肌，除去一侧贝壳和外套膜，然后用手术刀在贝体的背体中央，壳顶下方、有围心腔内的三角形心脏割下，将心脏组织剪成5 * 5 * 2 mm的小块。然后立即将心脏组织浸泡于4%多聚甲醛液固定至少24 h，固定标本采用常规石蜡包埋技术处理。从制备的石蜡块中获得切片，利用Al-subiai (2011)的方法，制备毛蚶心脏组织切片。在波恩氏液中固定12~24 h后，转移到70%酒精中保存。然后经70%、85%、95%、100%、100%乙醇梯度脱水后(每级30 min)，迅速放入二甲苯酒精溶液中进行透明处理，随后装入包埋机石蜡槽中进行浸蜡，然后在自动组织包埋机(EG1150H，莱卡，德国)中进行组织包埋。包埋后的石蜡块进行边缘休整后，上轮转式切片机(RM2128，莱卡，德国)进行切片操作。在展片台上烘片之后，放入自动染色机(X，莱卡，德国)中，调好染色程序进行染色然后用二甲苯脱蜡，用分级醇再水合，并用苏木精和伊红染色。显微镜下观察H&E染色切片，切片厚度6~7 μm，采用Motic BA600-4数字切片扫描与应用系统高精度扫描切片，用Motic数字切片助理Lite 1.0观察组织，采集图片。光镜观察并与对照组样本比较。

2.3.3. 死亡率计算

每24 h查看毛蚶死亡情况并将死亡毛蚶捞出。毛蚶死亡判定标准：双壳持续张开，斧足异常伸出体外且对刺激无反应，外套膜萎缩。计算死亡率。

3. 结果与分析

毛蚶的心脏由心耳和心室组成，在贝体的背面中央，顶下方、有围心腔的构造，心室一个，腹面被直肠穿过，心室左右各有一个三角形的心耳，心耳壁较薄。毛蚶的心脏由心外膜和心肌细胞构成，心肌纤维有分支，排列松散，形态整齐，核椭圆型，心肌细胞形态规则，结构完整，排列松散。无纤维化表现(图1A，图1B)。由表2可知，对照组并未出现死亡现象。

5 mg/L Cd²⁺胁迫24 h与对照组相比无明显变化；48 h心肌纤维之间出现空隙(图1C，图1D)。20 mg/L Cd²⁺胁迫24 h心肌纤维间隙增大，出现心肌纤维断裂，细胞出现水肿肥厚现象，少数心肌细胞坏死，大部分细胞区域出现纤维化；48 h心肌纤维间隙大而密集，心肌纤维断裂，心肌细胞大部分出现水肿浸润现象，有出血，部分细胞坏死，细胞纤维化(图1E，图1F)，且48 h内毛蚶死亡率为62.5% (表2)。

5 mg/L Hg²⁺胁迫24 h后，部分心肌纤维之间产生空隙，有肌纤维断裂和浸润现象；48 h空隙增多，且有细胞坏死现象(图1G，图1H)。20 mg/L Hg²⁺胁迫24 h后心肌纤维间隙大而密集，血淋巴细胞浸润严重，心肌细胞坏死紊乱，大部分细胞区域纤维化；48 h心肌水肿空泡变性，肌纤维崩解坏死区域增大，部分区域失去心肌组织应有的结构，血淋巴细胞大量浸润，核质分离，细胞纤维化明显(图1I，图1J)。且48 h内未出现毛蚶死亡现象(表2)。

5 mg/L Cd²⁺ + Hg²⁺胁迫24 h后心肌纤维之间部分有空隙，48 h空隙增大，出现心肌细胞水肿现象，细胞区域出现纤维化(图1K，图1L)；20 mg/L Cd²⁺ + Hg²⁺胁迫24 h，心肌纤维间隙增大，出现肌纤维断裂，细胞浸润并有不同程度的浑浊肿胀，少数心肌细胞坏死；48 h后心肌纤维间隙大而密集，心肌纤维断裂，有出血，部分心肌细胞出现纤维化，心肌细胞大部分出现水肿浸润现象，部分细胞坏死(图1M，图1N)。毛蚶48 h死亡率为37.5% (表2)。

Table 2. The mortality of Scapharca subcrenata at 24 h and 48 h under single and combined exposure of different Cd and Hg concentration gradients

表2. 不同Cd和Hg浓度梯度单一和联合暴露下毛蚶24 h、48 h死亡率

浓度(mg/L)	24 h死亡率	48 h死亡率
对照组	0	0
5 mg/L Cd^2+	0	0
5 mg/L Hg^2+	0	12.5%
20 mg/L Cd^2+	25%	62.5%
20 mg/L Hg^2+	0	0
5 mg/L Cd^2+ + Hg^2+	0	0
20 mg/L Cd^2+ + Hg^2+	12.5%	37.5%

A, B：对照组；C: 5 mg/L Cd²⁺ 24 h; D: 5 mg/L Cd²⁺ 48 h; E: 20 mg/L Cd²⁺ 24 h; F: 20 mg/L Cd²⁺ 48 h; G: 5 mg/L Hg²⁺ 24 h; H: 5 mg/L Hg²⁺ 48 h; I: 20 mg/L Hg²⁺ 24 h; J: 20 mg/L Hg²⁺ 48 h; K: 5 mg/L Cd²⁺ + 5 mg/L Hg²⁺24 h L: 5 mg/L Cd²⁺ + 5 mg/L Hg²⁺ 48 h; M: 20 mg/L Cd²⁺ + 20 mg/L Hg²⁺ 24 h N: 20 mg/L Cd²⁺ + 20 mg/L Hg²⁺ 48 h (注：1为100 μm，2为25 μm，2为1中方框局部放大图。箭头表示异常，向上箭头表示坏死细胞，向下箭头表示肌纤维水肿浸润，向左箭头表示代表性的纤维化，向右箭头表示肌纤维间隙增大)。

Figure 1. HE staining of heart tissue of Tegillarca subcrenata by Cd²⁺ Hg²⁺

图1. Cd²⁺ Hg²⁺对毛蚶心脏组织的HE染色

4. 讨论

海洋生物，尤其是滤食性双壳贝类，一旦海水受到重金属污染，其生存环境将面临严峻挑战[13]。本研究旨在通过系统分析Cd²⁺和Hg²⁺对毛蚶心脏的单一及联合胁迫，进而深入探讨其毒性效应。研究发现，Cd²⁺和Hg²⁺可导致心肌组织显著损伤。通过组织切片染色评估结果显示，相较于对照组，单独或联合处理组的心肌细胞形态变化显著，尤其是炎症症状和纤维化程度的显著增加，且此变化随时间和浓度呈正相关趋势(图1E，图1N)。进一步分析发现，重金属的直接毒性可导致心肌细胞坏死，而间接毒性则促进细胞迁移和重组[23]。已有研究指出，炎症和纤维化是导致心功能障碍的主要因素[24]。本研究中观察到的心肌炎症、心肌细胞坏死、心肌纤维水肿及出血反映了毛蚶心肌间质内细胞浸润和心肌细胞变质性的增加，从而进一步导致肌纤维间隙扩大(图1)。这与王来的研究结果一致，Cd²⁺导致心肌的肌肉层被空区所取代，电子密度降低[22]。纤维化则是多种器官共有的病理改变，其主要特征是纤维结缔组织的增加及实质细胞减少，长期发展可导致器官结构与功能受损[25]。对比分析发现，Cd²⁺对紫贻贝[26]、小鼠[27] [28]、白化大鼠[29]、猪[14]、长江河蟹[16]、日本鹌鹑[18]以及心肌细胞均造成不同程度的病理损伤，其通过Ca²⁺通道或其他途径进入心肌细胞，引起心肌细胞坏死和离子稳态失衡，进而导致心肌纤维间隙增大，心肌水肿和炎症细胞浸润，这与本研究观察结果一致。而Hg²⁺对两种淡水鱼造成的心肌细胞损伤，影响了细胞内钙动力学、心肌收缩力及心脏电传导，这可能与心输出量减少和心力衰竭相关[30]。镉和汞的联合暴露可增加小鼠心肌细胞的血液中金属水平。无机汞通过抑制Na⁺/K⁺ ATP酶、SERCA和肌球蛋白ATP酶，破坏E-C偶联功能，对哺乳动物心脏造成损害[31] [32]。毛蚶心脏的效能高度依赖于心肌收缩力，而心肌收缩力又受细胞内Ca²⁺稳态的影响。在正常生理状态下，细胞内外Ca²⁺浓度保持相对稳定的梯度差，这种平衡的维持依赖于一系列的转运机制，以确保细胞内维持低钙状态。然而，重金属的刺激导致细胞处于钙超载状态，增多的胞浆内Ca²⁺会促使ROS过量产生，引起膜脂过氧化，破坏细胞膜和线粒体结构与功能，激活内源性核酸等多种酶，引发核DNA降解，诱导细胞凋亡，最终导致细胞、组织和器官的损伤及功能障碍[33] [34]。镉对线粒体的损害较汞更为显著，而汞在更趋于诱导纤维化。这些是氧化损伤的典型特征[25]。从本研究的结果中不难看出，当重金属超过一定的浓度时，必然会对心肌造成影响。

总的来说，对毛蚶心脏基于重金属胁迫组织病理反应的探究，能够使我们更系统全面地了解重金属胁迫对于贝类的毒性作用，为进一步研究贝类循环系统的适应性提供了科学基础，增加了我们对贝类心脏组织结构、功能以及对环境变化的适应性的理解，更深入透彻地理解其背后地生理机制做铺垫。

5. 结论

研究结果显示，Cd²⁺和Hg²⁺可引起毛蚶心肌损伤，如心肌纤维断裂、细胞水肿或坏死，细胞间隙增大；以及纤维排列紊乱和纤维化等病理现象。随重金属浓度增加，病理程度加重。此外，两种金属对毛蚶生理的毒性作用呈现出拮抗关系。

致 谢

感谢我的导师梁爽老师的指导，感谢我的家人的陪伴，感谢我的朋友的倾听，感谢我的母校培养。

基金项目

国家自然科学基金(项目编号：31902369、31972814和42076121)、现代农业产业技术体系专项资金资助(项目编号：CARS-49)、天津市高校基本科研业务费(项目编号：2019KJ041、2021KJ109和2022KJ020)、天津市渔业发展支持政策项目(项目编号：12000023P82963110017B)、福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室开放课题(项目编号：2021FJSCQ07)、天津市科技计划项目(项目编号：23ZYCGSN00040和23YDTPJC00560)。

NOTES

^*通讯作者。