RSRC1在非小细胞肺癌中的表达及生物学功能探究

Expression and Biological Function Exploration of RSRC1 in Non-Small Cell Lung Cancer

摘要: 目的：基于生物信息学分析以及qPCR技术探究RSRC1在非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)中的表达和临床价值。方法：结合癌症基因组图谱等多种数据库分析RSRC1在肿瘤中的表达与NSCLC病人的预后、病理学特征以及肿瘤免疫之间的关系并对RSRC1及其相关基因进行富集分析。通过qPCR技术验证RSRC1在NSCLC细胞株中的表达。结果：RSRC1在NSCLC以及其主要亚型中均表达升高。RSRC1的表达水平在NSCLC中与患者的预后、临床病理特征、免疫细胞以及免疫微环境均密切相关。RSRC1在NSCLC中可能参与细胞周期、DNA复制等生物学过程。RSRC1在NSCLC细胞株中mRNA表达升高。结论：RSRC1是NSCLC中一种重要的生物标志物，有成为NSCLC治疗靶点的潜力。

Abstract: Objective: Exploring the expression and clinical value of RSRC1 in NSCLC based on bioinformatics analysis and qPCR technology. Methods: Analyzing the relationship between the expression of RSRC1 in tumors and the prognosis, pathological characteristics, and tumor immunity of NSCLC patients by combining multiple databases such as the Cancer Genome Atlas (TCGA), and performing enrichment analysis on RSRC1 and its related genes, verifying the expression of RSRC1 in NSCLC cell lines through qPCR technology. Results: RSRC1 is upregulated in NSCLC and its major subtypes. The expression level of RSRC1 is closely related to the prognosis, clinical pathological indicators, immune cells, and immune microenvironment of NSCLC patients. RSRC1 may be involved in biological processes such as cell cycle and DNA replication in NSCLC. RSRC1 mRNA expression is elevated in NSCLC cell lines. Conclusion: RSRC1 is an important biomarker of NSCLC and has potential as a therapeutic target for NSCLC.

1. 前言

据美国癌症协会推测，2024年美国死于肺癌、结直肠癌以及胰腺癌的人数最多，而每天约有340人死于肺癌，是第二名结直肠癌死亡人数的近2.5倍[1]。临床上，非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)是肺癌病人中最常见的类型，约占总数的85%左右[2]。尽管一些新型疗法如靶向治疗、免疫治疗[3]取得了很大的进展，但受益人群仍十分有限[4]。因此，探索新的诊断和预后生物标志物，提高NSCLC的早期诊断和治疗就显得尤为重要。RSRC1 (Arginine (R)/serine (S)-rich coiled-coil 1)编码富含丝氨酸和精氨酸的SR蛋白(Serine- and arginine-rich proteins)，该蛋白家族结构上都具有富含丝氨酸和精氨酸的RS结构域，该区域不仅介导蛋白质与蛋白质之间的相互作用，同时也参与蛋白质与RNA之间的相互作用[5]。RSRC1参与细胞内多种生物学过程，如mRNA剪接[6]、蛋白质类泛素化修饰[7]等。

然而，RSRC1在NSCLC患者中的生物学功能、临床意义和分子机制仍不清楚，仅在一项针对肺鳞癌中异常RNA结合蛋白的研究中被确定为九个与预后相关的基因之一[8]。本研究通过生物信息学分析了RSRC1在NSCLC中的表达及其与预后、临床病理特征之间的关系，然后结合多种数据库推测RSRC1在NSCLC中发挥作用的可能机制，最后通过qPCR验证RSRC1在常见NSCLC细胞株中的表达情况。

2. 材料与方法

2.1. NSCLC表达谱数据及临床样本信息来源

我们从UCSC XENA (https://xenabrowser.net/)网站中下载了经统一标准化的泛癌数据集：TCGA TARGET GTEx (PANCAN, N = 19131, G = 60499)，以及1041例NSCLC患者RSRC1的基因表达数据和患者临床资料，RNA测序数据值统一转换为log2 (TPM + 1)进行分析。患者的临床资料包含了患者年龄、性别、吸烟状态、T分期，N分期，M分期以及Stage分期等。同时从GEO数据库 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下载NSCLC数据集GSE19188。RSRC1在LUAD以及LUSC中蛋白表达水平数据来自UALCAN数据库(http://ualcan.path.uab.edu/index.htmL)。

2.2. RSRC1在NSCLC中预后以及诊断价值

通过Kaplan-Meier Plotter (https://kmplot.com/analysis/index)在线数据库，我们依据RSRC1的表达量将样本分为RSRC1的高表达组和低表达组，并绘制K-M生存曲线图，通过Log-rank检验评估曲线之间是否存在统计学差异。Log-rank检验的P值小于0.05被认为具有统计学意义，该值以及风险比(Hazard ratio, HR)显示在图片右上方。使用R包“pROC”评估RSRC1对NSCLC的诊断价值并绘制受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve，ROC曲线)，X轴和Y轴分别代表特异性和敏感性，一般认为，AUC > 0.8具有较高的诊断价值。

2.3. RSRC1与NSCLC临床特征分析

我们将从UCSC Xena下载的NSCLC患者RSRC1表达数据和相应的临床数据通过函数VLOOKUP匹配和整合，采用Mann-Whitney非参数检验计算P值。采用卡方检验评估不同临床参数下基因表达的差异，对于样本量小于5的情况，采用连续校正卡方检验进行计算。P < 0.05表示具有统计学意义。

2.4. NSCLC中RSRC1共表达基因的功能富集分析

为了验证RSRC1的生物学功能，我们首先利用GEPIA2在线数据库(http://gepia2.cancer-pku.cn/)，从TCGA和GTEx项目获取了与NSCLC中与RSRC1关系最相近的200个基因。然后，我们通过使用基于基因本体论(Gene Ontology, GO)、京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)的“cluster Profiler”R包进行了富集分析[9]。此外，KEGG基因集和Hallmark基因集被用来进行基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis, GSEA)。当基因集满足某些标准(如|NES| > 1，P < 0.05，FDR < 0.25)时，我们认为显著富集，功能富集分析结果使用“ggplot2”R包进行可视化。

2.5. RSRC1在NSCLC中与免疫细胞以及免疫微环境的关系

结合整理的基因表达数据，通过R软件包“IOBR”[10]，使用“Timer”算法[11]对LUAD以及LUSC患者的6种免疫细胞(B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞)的浸润状态进行评估。Pearson相关分析用于进一步确定各种免疫细胞与RSRC1表达的相关性。通过R包“ESTIMATE”[12]计算来自LUAD以及LUSC肿瘤样本的基质细胞评分(Stromal Score)、免疫细胞评分(Immune Score)、基质与免疫细胞联合评分(Estimate Score)。这三种评分基于Estimate算法，可以帮助量化肿瘤中免疫和基质的成分，通过分析免疫细胞和基质细胞的特定基因表达特征来计算免疫和基质分数，以预测非肿瘤细胞的浸润。

2.6. 细胞培养

人肺上皮细胞株BEAS-2B、人肺癌细胞株A549，NCI-H1299，PC-9和HCC827均购买自武汉普诺赛生命科技有限公司。上述细胞均在设定条件为37℃、85%湿度、5%二氧化碳的培养箱中并使用含有10% FBS和1%青链霉素混合液的推荐培养基培养(F-12K用于A549；RPMI-1640用于BEAS-2B、NCI-H1299、PC9以及HCC827)。每天在显微镜下观察细胞生长状态、有无污染并做好记录，每隔1~2天更换新鲜培养基直至细胞密度约为80%~90%时，应用于后续实验。

2.7. qPCR检测

使用Total RNA提取试剂盒(Vazyme，中国)提取NSCLC细胞RNA；然后根据制造商说明，使用逆转录酶试剂盒和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme，中国)对RNA进行逆转录以及qPCR检测。反应结束后，导出数据，使用2^−ΔΔCT法统计结果。引物序列见表1。

Table 1. qPCR primers

表1. qPCR引物

Gene	Forward Primer	Reverse Primer
RSRC1	TCAAACGTGGGGAATCTGGA	TGGCTTGGTCTTCCTCCTT

3. 结果

3.1. RSRC1在NSCLC中表达升高

Figure 1. Expression level of RSRC1 in NSCLC. (a): Expression of RSRC1 in 33 tumor samples and corresponding normal samples in the TCGA-GTEx database. (b): MRNA expression of GEO database RSRC1 in NSCLC and adjacent cancer samples. (c)~(d): Protein expression levels of ULCAN database RSRC1 in tumor and adjacent samples of LUAD and LUSC. (e)~(g): Immunohistochemical images of RSRC1 protein expression in normal tissues, LUAD, and LUSC

图1. RSRC1在NSCLC中的表达水平。(a)：RSRC1在TCGA-GTEx数据库中33种肿瘤样本和对应正常样本的表达情况。(b)：GEO数据库RSRC1在NSCLC和癌旁样本中的mRNA表达。(c)~(d)：ULCAN数据库RSRC1在LUAD与LUSC中肿瘤样本和癌旁样本的蛋白表达水平。(e)~(g)：RSRC1在正常组织与LUAD、LUSC中RSRC1蛋白表达的免疫组化图像

Figure 2. Clinical significance of RSRC1 in NSCLC. (a)~(b): K-M survival curve and ROC curve of NSCLC patients. (c): The correlation between RSRC1 expression and immune cells in LUAD and LUSC. (d): GO and KEGG functional enrichment analysis of RSRC1 related genes. (e)~(f): GSEA analysis of genes related to RSRC1

图2. RSRC1在NSCLC中的临床意义。(a)~(b)：NSCLC患者的K-M生存曲线图以及ROC曲线图。(c)：LUAD与LUSC中RSRC1表达与免疫细胞的相关性。(d)：与RSRC1相关基因的GO和KEGG功能富集分析。(e)~(f)：与RSRC1相关的基因的GSEA分析

如图1(a)所示，可以发现RSRC1在包括LUAD以及LUSC这两种常见的NSCLC亚型的大部分癌种中均存在mRNA水平上的差异，肿瘤组织的表达水平显著高于癌旁正常组织。为了验证结果的可靠性，我们通过GEO数据库的独立数据集(GSE19188)进行分析，发现与癌旁正常样本(N = 65)相比，在NSCLC (N = 91)中RSRC1的表达同样出现了显著升高(P = 2.10E−11) (图1(b))。同时，在LUAD以及LUSC中，RSRC1在肿瘤组织的蛋白表达水平显著高于癌旁正常组织(图1(c)，图1(d))。此外，图1(e)~(g)中来自HPA数据库的免疫组化图像显示LUAD、LUSC肿瘤组织中RSRC1为中等染色强度，而正常肺上皮组织中RSRC1染色强度较低。

3.2. RSRC1表达与NSCLC预后不良相关

图2(a)显示了K-M生存分析的结果，可以发现RSRC1高表达与NSCLC患者的预后不良显著相关(Logrank P = 4.3e−13, HR = 1.73)，这说明RSRC1很有可能是NSCLC患者总生存期(Overall survival, OS)的预后标记物。如图2(b)显示，在NSCLC中RSRC1的曲线下面积(Area under curve, AUC)为0.846 (95% CI = 0.822 − 0.69)。这表明RSRC1表达是NSCLC患者的良好诊断候选标志物。

3.3. RSRC1表达与NSCLC临床病理特征相关

RSRC1的表达与NSCLC患者性别(P < 0.001)、吸烟状况(P < 0.001)、肿瘤大小(P = 0.008)和淋巴结转移(P = 0.023)显著相关(见表2)。

Table 2. Distribution characteristics of RSRC1 expression in clinical data of NSCLC patients (n = 1041)

表2. NSCLC 患者RSRC1表达在临床资料的分布特征(n = 1041)

Characteristics	Low expression of RSRC1	High expression of RSRC1	P value
n	520	521
Age, n (%)			0.049
≤65	238 (23.5%)	210 (20.7%)
>65	265 (26.2%)	300 (29.6%)
Gender, n (%)			<0.001
Male	257 (24.7%)	364 (35%)
Female	263 (25.3%)	157 (15.1%)
Smoker, n (%)			<0.001
Yes	432 (42.6%)	488 (48.1%)
No	73 (7.2%)	22 (2.2%)
Pathologic T stage, n (%)			0.008
T1	169 (16.3%)	121 (11.7%)
T2	273 (26.3%)	313 (30.2%)
T3	57 (5.5%)	63 (6.1%)
T4	18 (1.7%)	24 (2.3%)
Pathologic N stage, n (%)			0.023
N0	340 (33.4%)	330 (32.4%)
N1	96 (9.4%)	132 (13%)
N2 & N3	68 (6.7%)	53 (5.2%)
Pathologic M stage, n (%)			0.759
M0	367 (45.4%)	410 (50.7%)
M1	16 (2%)	16 (2%)
Pathologic stage, n (%)			0.214
Stage I	285 (27.7%)	256 (24.9%)
Stage II	130 (12.6%)	157 (15.3%)
Stage III	80 (7.8%)	88 (8.6%)
Stage IV	17 (1.7%)	16 (1.6%)

3.4. RSRC1表达在NSCLC中与肿瘤免疫相关

Figure 3. Relationship between RSRC1 and immunity in NSCLC and mRNA expression. (a)~(c): Correlation between RSRC1 expression and ImmuneScore, StromalScore, and EstimateScore in LUAD and LUSC. (d): QPCR was used to detect the mRNA level of RSRC1 in NSCLC cell lines. (***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05)

图3. RSRC1在NSCLC中与免疫的关系及mRNA表达。(a)~(c)：LUAD和LUSC中RSRC1表达与ImmuneScore、StromalScore和EstimateScore的相关性。(d)：qPCR检测RSRC1在NSCLC细胞系中的mRNA水平。(***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05)

在LUAD和LUSC中RSRC1表达与B细胞、CD4+T细胞均呈负相关(P < 0.05；图2(c))；在LUAD中RSRC1表达与 CD8+T 细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞呈正相关；而在LUSC中RSRC1表达与CD8+T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞呈负相关；这些结果表明RSRC1可能参与了肿瘤免疫过程。此外，分别评估RSRC1与Stromal Score、Immune Score、Estimate Score三个免疫评分之间的相关性，均表明RSRC1的表达与免疫浸润呈显著负相关(图3(a)~(c))。尽管这三个分数在数值上有所不同，但总体趋势表现出的一致性表明RSRC1在LUAD与LUSC中一定程度上调节肿瘤微环境(Tumor microenvironment, TME)。

3.5. RSRC1参与NSCLC中多种生物学过程

GO/KEGG富集分析结果如图2(d)所示，细胞组分富集表明，RSRC1相关基因主要集中在染色体区，纺锤体等；分子功能富集表明，这些分子主要富集在DNA复制、姐妹染色单体分离、细胞器裂变等；分子功能则集中富集在DNA解旋酶活性上。KEGG富集分析显示，RSRC1与细胞周期、错配修复、DNA复制等信号通路相关。GSEA富集分析结果如图2(e)~(f)所示，在Hallmark基因集中，主要与mTOR通路、IL-6/JAK/STAT3通路相关；在KEGG基因集中，则富集在NK细胞毒性，细胞周期和DNA复制等。

3.6. RSRC1在NSCLC细胞中mRNA呈高表达

如图3(d)所示，和BEAS-2B相比，RSRC1的mRNA表达水平在A549、PC-9、NCI-H1299、HCC827中较高，与上述生物信息学分析趋势相符。

4. 讨论

癌症在全球每个国家都是导致死亡的主要原因以及增加预期寿命的主要障碍，目前恶性肿瘤的有效治疗仍然存在不足，如抗肿瘤药物的使用产生耐药性以及药物不良反应等[13]。先前的研究表明，分子生物标志物可以作为肿瘤的早期检测、诊断、预后、治疗、药物反应预测、和个体化精准治疗的工具[14]。同时，肿瘤免疫治疗的出现，如免疫检查点阻断剂[15]和嵌合抗原受体T细胞治疗[16]，已经取得了显著的进展。然而，人们发现TME的异质性会限制这些治疗方法的临床疗效[17]。这突显了需要新型预测性生物标志物来定制个性化肿瘤精准治疗的必要性。我们的研究确定了RSRC1作为NSCLC诊断和预后标志物，是一种新的潜在治疗靶点，可以用来指导个性化治疗策略的制定。

目前已有研究表明，RSRC1不仅与精神分裂症和智力缺陷等神经疾病存在关联[18] [19]，而且与胃癌[20]、食管癌[21]以及神经母细胞瘤[22]等各种癌症相关。同时，RSRC1在细胞生物学功能中也发挥重要的作用，如与雌激素受体相互作用，在神经、内分泌、心血管和免疫系统中发挥作用[23]。还有研究发现，RSRC1可能参与特发性肺动脉高压的发生[24]。然而，RSRC1在NSCLC以及两种主要亚型LUAD和LUSC中是否具有临床意义和生物学功能尚未有报道。我们的研究首次分析了RSRC1在NSCLC中的表达以及临床意义。与正常组织相比，RSRC1在NSCLC以及两种主要亚型LUAD以及LUSC中均为高表达。同时，RSRC1的表达水平在NSCLC中与患者的预后、临床病理指标、免疫细胞以及免疫微环境密切相关，同时对NSCLC具有可靠的诊断价值。RSRC1在NSCLC中可能参与细胞周期、DNA复制、影响NK细胞毒性以及mTOR信号通路等生物学过程。TME是肿瘤细胞复杂的生存环境，主要包括免疫细胞、间充质细胞、血管和细胞外基质等主要成分[25]。近年来，越来越多的证据表明TME中的免疫细胞浸润水平降低会刺激肿瘤的发生发展[26] [27]。同时，TME中的免疫细胞会显著影响癌症的治疗结果[28]。因此，TME内的新靶点可以帮助改善宿主抗肿瘤免疫反应，促进新的治疗策略的发展。但关于RSRC1异常表达是否影响免疫细胞浸润的报道还很少。我们的研究结果首次表明LUAD中RSRC1高表达会减少CD4+T细胞的浸润；在LUSC中RSRC1的表达升高与CD4+T细胞以及DC细胞等免疫细胞的浸润均为负相关，可能导致肿瘤抑制的TME并影响NSCLC患者免疫治疗的疗效[29]。“Immunescore”是一种基于肿瘤组织免疫细胞密度以及分布来量化免疫细胞浸润水平的一种方法，并被证明优于TNM分期对结直肠癌患者的分类[30]。我们观察到在LUAD与LUSC中，RSRC1表达水平与3种肿瘤免疫评分之间存在显著负相关性，表明RSRC1可能在调节TME中发挥重要作用并与NSCLC患者的免疫状态紊乱相关。为了进一步了解RSRC1在NSCLC中发挥生物学作用的机制，我们通过富集分析以及互作网络分析研究在NSCLC中与RSRC1相关的分子以及与RSRC1之间存在相互作用的分子具体是通过哪些途径来影响NSCLC的发生发展。有趣的是，在对RSRC1相互作用分子进行GO富集分析的结果显示，这些分子往往富集在细胞剪接体中，这与国外一项敲除RSRC1导致SH-SY5Y细胞选择性剪接受损的结果体现了一致性[18]。在KEGG富集分析、GSEA分析均发现RSRC1可能与细胞周期以及DNA复制密切相关。研究发现，癌症发生的主要机制之一是异常的细胞周期进展[31]，同时DNA复制异常也是癌症的标志之一，癌基因往往通过刺激DNA复制来促进细胞生长。因此，RSRC1可能通过影响细胞的周期以及DNA复制进而影响NSCLC的发生发展。

5. 结论

综上所述，我们的研究表明，RSRC1作为NSCLC的治疗靶点的潜力是有前景的，值得进一步研究其在NSCLC中的具体作用和机制。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。