癫痫所致CD57小鼠脑组织海马区小胶质细胞极化后基因的富集分析

Enrichment Analysis of Microglia Polarized Genes in the Hippocampus of Epileptic CD57 Mouse

摘要: 目的：研究癫痫对C57小鼠脑组织海马区小胶质细胞极化后基因的富集分析。方法：将40只C57小鼠利用随机分组的方法随机分为对照组(CNC组12只)和癫痫组(OPTZ组28只)。CNC组每隔一天腹腔注射生理盐水，OPTZ组每隔一天腹腔注射戊四唑，共28天。在诱导癫痫的实验过程中，观察小鼠的日常行为、癫痫发作程度、癫痫持续时间和癫痫发作后的结局。实验结束后采集样本，进行转录组测序分析。OE生物技术有限公司(上海，中国)负责样品Methylation EPIC Bead Chip实验结果和数据分析的进行。结果：转录组相关测序显示癫痫发作改变小鼠脑组织海马区小胶质细胞M2型的基因表达，其中表达上调基因245个，表达下调基因88个，GO富集分析显示上调基因富集于影响小胶质细胞生长和增殖的通路。结论：癫痫发作改变小鼠海马区小胶质细胞的基因表达且富集于抑制小胶质细胞生长发育通路。

Abstract: Objective: To study the gene enrichment of microglia in hippocampal region of C57 mouse brain after polarization induced by epilepsy. Methods: 40 C57 mice were randomly divided into control group (12 in CNC group) and epilepsy group (28 in OPTZ group). The CNC group was intraperitoneally injected with normal saline every other day, and the OPTZ group was intraperitoneally injected with pentatetrazole every other day for 28 days. In the course of the experiment to induce epilepsy, the daily behavior of the mouse, the degree of seizure, the duration of seizure and the outcome after seizure were observed. After the experiment, the samples were collected and analyzed by transcriptome sequencing. OE Biotechnology Co. Ltd. (Shanghai, China) was responsible for the experimental results and data analysis of the sample, Methylation EPIC Bead Chip. Results: Transcriptome sequencing showed that seizures changed the M2 gene expression of microglia in the hippocampus of mouse brain tissue, including 245 up-regulated genes and 88 down-regulated genes. GO enrichment analysis showed that up-regulated genes were enriched in the pathway affecting the growth and proliferation of microglia. Conclusion: Epileptic seizure changes the gene expression of microglia in the hippocampus of mouse and is concentrated in the pathway that inhibits the growth and development of microglia.

1. 引言

癫痫是一种以中枢神经系统暂时性功能障碍为特征，由脑神经细胞异常放电引起的慢性脑部疾病[1]，影响患者的行为、认知等方面。目前，药物治疗仍是癫痫的主要治疗手段，但其本质是抗癫痫，而不是改善癫痫的后果[2]。小胶质细胞是大脑中的先天免疫细胞，是病理性损伤的第一反应者[3]，发挥着与巨噬细胞类似的重要作用，如吞噬异物和死细胞，并释放趋化因子和细胞因子。它在维持中枢神经系统的稳态中也起着关键作用[4]，静息状态下，小胶质细胞对神经系统起到监视维持内稳态的作用，其活化后，起到吞噬细胞碎片的作用，同时在不同病理条件下分泌不同的细胞因子起到神经保护与神经毒性双重作用[5]。因此，关于癫痫发作中脑组织损伤与基因表达关系的报道很少。因此，本文采用转录组测序和GO富集分析的方法，探索癫痫在脑组织中基因表达变化后富集的相关基因及其相关功能。

2. 材料与方法

2.1. 材料

实验用C57雄性小鼠40只，清洁级18~20 g，自由饮食，室内温度22℃ ± 3℃，相对湿度50% ± 10%。3 d更换床上用品，干燥、干净，环境安静舒适。戊四唑(PTZ)，购自Sigma公司；0.9%的盐水。

2.2. 方法

样品Methylation EPIC Bead Chip实验、数据分析和富集分析由OE biotech Co. Ltd. (Shanghai, China)完成。

3. 结果

3.1. 转录组测序差异基因(表1)

Table 1. The first 48 differential genes were sequenced by transcriptome

表1. 转录组测序前48个差异基因

Gene_id	P-value	Regulation	Description
Ttr	5.22E−218	Up	transthyretin
Npas4	1.95E−80	Up	neuronal PAS domain protein 4
Ptgs2	1.66E−74	Up	prostaglandin-endoperoxide synthase 2
Avp	2.38E−71	Up	arginine vasopressin
Fosb	2.79E−60	Up	FBJ osteosarcoma oncogene B
Pmch	4.61E−57	Up	pro-melanin-concentrating hormone
Fos	5.02E−41	Up	FBJ osteosarcoma oncogene
Oxt	3.05E−40	Up	oxytocin
Egr2	4.58E−29	Up	early growth response 2
Baiap3	1.71E−26	Up	BAI1-associated protein 3
Col10a1	7.73E−25	Up	collagen%2C type X%2C alpha 1
Nptx2	1.35E−23	Up	neuronal pentraxin 2
Rgs2	3.58E−23	Up	regulator of G-protein signaling 2
Egr4	1.65E−22	Up	early growth response 4
Gm13889	2.10E−22	Up	predicted gene 13889
Trh	2.43E−22	Up	thyrotropin releasing hormone
Junb	3.03E−21	Up	jun B proto-oncogene
Arl4d	6.32E−19	Up	ADP-ribosylation factor-like 4D
Ndst4	1.21E−17	Down	N-deacetylase/N-sulfotransferase (heparin glucosaminyl) 4
Ecel1	1.33E−17	Up	endothelin converting enzyme-like 1
Btg2	1.79E−17	Up	BTG anti-proliferation factor 2
Abi3bp	2.09E−17	Down	ABI gene family%2C member 3 (NESH) binding protein
Errfi1	5.24E−16	Up	ERBB receptor feedback inhibitor 1
Gh	8.04E−16	Down	growth hormone
Gadd45g	6.38E−15	Up	growth arrest and DNA-damage-inducible 45 gamma
Pcdh8	7.38E−15	Up	protocadherin 8
Irs4	7.49E−15	Up	insulin receptor substrate 4
Atf3	9.18E−15	Up	activating transcription factor 3
Dusp6	1.34E−14	Up	dual specificity phosphatase 6
AW551984	1.35E−14	Up	expressed sequence AW551984
Peg10	4.13E−14	Up	paternally expressed 10
Otp	1.98E−13	Up	orthopedia homeobox
Dlk1	2.76E−13	Up	delta like non-canonical Notch ligand 1
Hcrt	4.74E−13	Up	hypocretin
Jun	5.92E−13	Up	jun proto-oncogene
Gal	1.35E−12	Up	galanin and GMAP prepropeptide
Rrad	2.49E−12	Up	Ras-related associated with diabetes
Arhgap36	7.52E−12	Up	Rho GTPase activating protein 36
Fibcd1	1.13E−11	Down	fibrinogen C domain containing 1
Agt	3.09E−11	Up	angiotensinogen (serpin peptidase inhibitor%2C clade A%2C member 8)
Dusp5	1.14E−10	Up	dual specificity phosphatase 5
Nfkbiz	1.64E−10	Up	nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B cells inhibitor%2C zeta
Nr4a3	2.88E−10	Up	nuclear receptor subfamily 4%2C group A%2C member 3
Egr3	3.40E−10	Up	early growth response 3
Nr4a1	5.77E−10	Up	nuclear receptor subfamily 4%2C group A%2C member 1
Calcr	5.77E−10	Up	calcitonin receptor
Gabrq	7.40E−10	Up	gamma-aminobutyric acid (GABA) A receptor%2C subunit theta
Gm2004	8.67E−10	Down	predicted gene 2004

3.2. 基因在每一个样本中的表达

对癫痫小鼠脑组织样本进行测序分析。通过绘制火山图可以了解差异表达基因的整体分布情况。各组实验设计中筛选出来差异基因的火山图(图1(a))，将比较所产生的差异情况反映到火山图中，灰色为非显著性差异的基因，红色和蓝色为显著性差异基因，图中标注的基因为上调和下调基因中最具有差异性的TOP10基因。第一圈表示上调基因(浅红色)和下调基因(浅蓝色)，圈的大小根据log2 (FC)值的大小而变化；差异基因雷达图(图1(b))第二圈表示外圈数据代表实验组的平均表达量；内圈数据代对照组的平均表达量；第三圈表示各个基因的实验组、对照组的平均表达量。如Fos、Fosb、Ptas2、Ttr等基因在对照组的表达量很高，在图中就会出现黄色尖峰。这也为癫痫相关研究提供分子层面的思路。

(a)

(b)

Figure 1. Transcriptome sequencing analysis. (a) Differential gene volcano map; (b) Differential gene radar map

图1. 转录组测序分析。(a) 差异基因火山图；(b) 差异基因雷达图

(a) (b)

(c)

Figure 2. GO enrichment analysis diagram. (A) All enriched genes TOP30; (B) Up-regulated genes TOP30; (C) TOP30 down-regulated genes

图2. GO富集分析和弦图。(A) 全部富集基因TOP30；(B) 上调基因TOP30；(C) 下调基因TOP30

3.3. GO富集分析

和弦图左侧为每个分类(BP-生物过程、MF-分子功能、CC-细胞组成)中|logFC|最大的10个基因，右侧反映分类组成情况，中间线条表示分类、基因对应关系。外侧热图表示对应基因的logFC值。全部基因和弦图(图2(a))可以筛选出上调和下调所有基因中最显著的相关基因和Terms；上调基因TOP30 (图2(b))可以筛选出相关不利基因；下调基因TOP30可以看出因为癫痫发作的影响对于正常表达的细胞功能的影响。便于我们通过其筛选出相关需要研究基因进行后续研究。

4. 讨论

癫痫是一组由脑部神经元异常过度放电引起的以短暂性的中枢神经系统功能失常为特征的慢性脑部疾病[6]。激活的小胶质细胞可通过释放大量炎性因子，引发神经毒性，诱导神经元损伤和凋亡，抑制神经元再生[7]。但是小胶质细胞在癫痫发作中的作用和机制尚未被具体阐明，因此转录组测序后利用富集分析的方法可以直观地展示癫痫发作后小胶质细胞的分子层面上的变化，后续可以从富集分析的相关Term中挑选出重要的基因，为癫痫改变小胶质细胞以及对小胶质细胞极化的影响的探究打下基础。氧化石墨烯富集分析中基因本体论(Gene Ontology, GO)是一个用于描述基因和基因产品属性的标准术语体系。它提供了一个有组织的方式来表示基因在生物体内的各种角色。基因本体论通常从三个层面对基因进行描述：细胞成分(Cellular Component, CC)、生物学过程(Biological Process, BP)和分子功能(Molecular Function, MF)。细胞成分(Cellular Component, CC)这个层面描述了基因产物(如蛋白质)在细胞内的定位。例如，它们可能位于细胞核、细胞质、线粒体膜或其他细胞器上。这有助于了解基因产物在细胞内的作用和功能；生物学过程(Biological Process, BP)这个层面描述了基因参与的生物学过程。这些过程可能包括细胞生长、信号传导、基因表达调控、代谢途径等。通过了解基因参与的生物学过程，我们可以更好地理解生物体的生理功能和疾病发生机制。分子功能(Molecular Function, MF)这个层面描述了基因产物在分子层面的功能，通常涉及与其他分子的相互作用或催化生化反应[8]。例如，某个基因产物可能是一个酶，它能够催化某个特定的生化反应；或者它可能是一个结构蛋白，参与细胞骨架的组装和维持。基因本体论为研究者提供了一个系统的方法来表示和共享关于基因和基因产品在生物体内的功能和过程的知识。这有助于促进基因功能研究的发展，提高研究效率，为疾病治疗和药物研发提供重要信息。

综上所述，我们利用“GO”这样一个建立的数据库，对于小鼠海马区脑组织的小胶质细胞的基因功能进行限定和描述，对对照组和癫痫组的CD57小鼠的脑组织海马区取样后利用氧化石墨烯(GO)富集分析，发现了癫痫的发作改变CD57小鼠脑组织海马区小胶质细胞的基因表达且富集于抑制小胶质细胞增殖和发育的相关通路，对于相关对于小胶质细胞有利的增长和发育的基因反而有所下调，证明癫痫的发作对于海马区脑组织的小胶质细胞的发育存在影响，但本研究的不足之处在于还未对相关基因进行进一步的深入探究，目前只收集相关因癫痫发作而受到影响的相关基因。所以，本文为更多在癫痫领域的研究以及癫痫的治疗方面提供了一种新的方法和思路及途径，后续的研究者可以利用对于相关重要基因的研究探究其在癫痫发作和持续发作的作用，为癫痫药物的研发和癫痫临床的治疗做出贡献。我们也将在后续研究中进一步关注其中的相关基因，进行下一步的研究。

基金项目

宁夏重点研发重点项目(项目编号：2023BEG02009)。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。